PBJ | 中国中医科学院黄璐琦院士团队联合北大张华伟构建丹参高效CRISPR/Cas9基因编辑系统

生信宝典 · 生物 · 5 天前

主要观点总结

该文章介绍了中国中医科学院黄璐琦团队等在药用植物丹参中建立的高效CRISPR/Cas9基因编辑系统。通过对不同发根农杆菌的测试和靶点设计原则的分析，成功构建了平均编辑效率72%，纯合/双等位突变效率30%的系统。该系统的建立为后续丹参中有效成分的生物合成途径解析和代谢网络的构建提供了基础。文章还分析了影响编辑效率的因素和突变类型。

关键观点总结

关键观点1: 研究背景

药用植物丹参在基因功能研究和品质改良方面具有巨大潜力，但存在纯合突变效率相对较低等问题。本文旨在建立高效的CRISPR/Cas9基因编辑系统以解决这些问题。

关键观点2: 研究方法

通过对241个靶点的多重比较和系统测试，确定了适合进行基因编辑的丹参材料。使用了不同发根农杆菌进行测试，并分析了影响编辑效率的因素。

关键观点3: 研究成果

建立了平均编辑效率72%，纯合/双等位突变效率30%的CRISPR/Cas9基因编辑系统。确定了C58C1和K599为高效菌株，并构建了丹参毛状根突变体库。

关键观点4: 研究意义

本文的研究为后续丹参中有效成分的生物合成途径解析和代谢网络的构建提供了重要基础数据，为丹参及其他药用植物的基因编辑研究提供了新的方向。

正文

CRISPR/Cas9作为强大的基因编辑工具，在基因功能研究和药用植物性状、品质精准改良等方面展现出巨大的潜力。丹参（ Salvia miltiorrhiza）为药用植物分子生物学研究的“模式植物”，是最早应用CRISPR/Cas9基因编辑系统解析丹参酮、丹酚酸类活性成分生物合成途径和调控基因的药用植物之一。但研究中存在纯合突变效率相对较低，难以获得纯合突变体等问题。同时，虽然目前已发表5个不同品种的丹参基因组，但仍未形成主流研究品种，为丹参基础科研数据的分享、交流及更深入的分子生物学研究带来了巨大的挑战。

近日，中国中医科学院黄璐琦/崔光红/郭娟与北京大学现代农业研究院张华伟合作，在Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了题为“Highly Efficient Agrobacterium rhizogenes-Mediated Gene Editing System in Salvia miltiorrhiza Inbred Line bh2-7”的研究论文。

本文通过对241个靶点在不同基因组及实验材料中的多重比较，确定自交6代白花丹参bh2-7为目前适合进行基因编辑研究的材料。通过5个发根农杆菌和121个基因170个靶点的系统测试共获得1664个纯合/双等位突变体，构建了平均编辑效率72%，纯合/双等位突变效率30%的高效CRISPR/Cas9基因编辑系统。靶点最高编辑效率和纯合/双等位突变效率可达100%和70%。通过对65个纯合/双等位突变效率低于10%靶点的系统分析，总结了影响丹参基因编辑效率的主要因素和靶点设计原则，并对形成的突变类型进行了统计分析，这些研究为后续丹参中有效成分的途径解析、代谢网络构建和利用基因编辑工具进行定向分子育种奠定了坚实的基础（图1）。

图1丹参自交系bh2-7 CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

首先，以bh2-7为参考基因组，对筛选的131个可能参与丹参酮或丹酚酸类化合物生物合成基因设计了241个sgRNA靶点，比较了这些靶点在不同品系材料（野生型紫花丹参和自交系bh2-7）以及相应基因组（DSS3和bh2-7）中位点变异的情况，发现bh2-7中靶点变异程度最低（12.03%）（图2b），由此确定自交系bh2-7为现阶段最佳的丹参基因编辑参考基因组及实验材料。

图2 241个靶点在丹参品系以及基因组中位点变异情况

以bh2-7为材料，测试了在丹参中应用较少的4种发根农杆菌（Ar.Qual，MSU440，Ar1193和K599）的诱导效率和编辑效率。发现4种发根农杆菌诱导效率均在79%以上，毛状根阳性率均为58%以上，具有较强的诱导毛状根的能力（图3）。而K599由于生长素的缺失，相比其他3种农杆菌，诱导毛状根时间较长（图3b，e）。

图3 4种发根农杆菌诱导丹参bh2-7生成毛状根的能力

在上述研究的基础上，增加了丹参中常用的发根农杆菌C58C1。使用生菜中高效基因编辑系统pZKD672，进一步评估5种发根农杆菌的编辑效率。其中C58C1和K599的编辑效率以及纯合/双等位突变效率最高，编辑效率分别为72.73%和58.7%，纯合/双等位效率分别为36.36%和19.57%。而另外3个菌株的编辑效率均低于25%，纯合/双等位突变效率低于1.5%，初步确定丹参中编辑效率最高的两个菌株C58C1和K599（图4）。

图4 丹参bh2-7不同发根农杆菌介导的CRISPR/Cas9编辑效率

为了进一步考察K599和C58C1的编辑效率，继续使用53个靶点对两个菌株进行测试。在K599中，20个sgRNAs检测了884个毛状根，在C58C1中，33个sgRNAs检测了1296个毛状根。K599和C58C1的平均编辑效率分别为71.82%和62.27%，其中sgRNA-220和sgRNA-25实现了100%的编辑效率。纯合/双等位突变效率相似，为20-30%，其中sgRNA-99和sgRNA-25达到70%的纯合/双等位突变效率（图5）。由此确定C58C1和K599是丹参CRISPR/Cas9基因编辑的高效菌株。

图5 丹参bh2-7 发根农杆菌C58C1和K599介导的CRISPR/Cas9编辑效率

由于K599诱导毛状根时间较长，具有较高的染菌风险。因此选择高效菌株C58C1进一步对117个靶点进行敲除。通过对5944个毛状根的检测，发现105个靶点成功突变，平均编辑效率和纯合/双等位突变效率为52.88%和17.23%。通过对121个基因的170个靶点进行突变，成功得到了103个基因132个靶点的1664个纯合/双等位突变体，实现了丹参毛状根突变体库的构建，为后续丹参中有效成分生物合成途径解析以及代谢网络的构建提供了基础。

虽然整体编辑效率较高，但少数靶点的编辑效率仍然较低，如在170个sgRNAs中有65个靶点的纯合/双等位效率低于10%，随后对可能影响丹参CRISPR/Cas9编辑效率的因素，如靶点GC含量，靶点中碱基的错配，同源基因的存在，靶点序列特异性以及二级结构的缺失进行了系统的分析（图6），发现58个靶点（89%）具有以上一个或多个因素。由于这些因素可以在靶点设计时进行避免，因此除去58个靶点后，总体编辑效率为71.96%，纯合/双等位突变效率为30.23%（图1）。通过分析低效率和高效率组中靶点特定位置的碱基分布规律，发现了丹参独有的偏好规律，为丹参及其他药用植物CRISPR/Cas9基因编辑靶点的设计提供了新方向（图6）。

图6 丹参中影响CRISPR/Cas9基因编辑效率的因素

最后，对获得的纯合/双等位突变体的突变类型进行分析。发现C58C1和K599介导的突变模式相似，主要表现出一个或两个核苷酸的插入和不同长度的缺失。

其中小片段的缺失（1-9bp）和单碱基插入占比最大，约70%（图7a），这提示丹参中DNA损伤修复的途径主要来源于非同源末端连接（NHEJ）。同时，丹参中也检测到超过9 bp的缺失（甚至达到15-40 bp），这可能代表微同源末端连接（MMEJ）的修复结果。突变类型中很大一部分是单碱基插入，A/T碱基插入占主导地位，约70%（图7b）。这些结果为丹参CRISPR/Cas9基因编辑系统的研发与应用提供了重要基础数据，为其规模化开发应用奠定了坚实的理论基础。

图7 53个sgRNAs引起的K599 和 C58C1的突变类型

该论文的通讯作者为中国中医科学院黄璐琦院士、中国中医科学院中药资源中心郭娟研究员、崔光红研究员，以及北京大学现代农业研究院张华伟研究员。中国中医科学院2022级博士研究生田梅，2021级博士研究生罗凌龙，中国中医科学院中药资源中心助理研究员靳保龙为论文的第一作者。该研究工作得到了中国中医科学院科技创新工程（CI2021A04109）、中央本级重大增减支项目“名贵中药资源可持续利用能力建设”（2060302）和泰山学者工程（TSQN202103160）等项目的资助。