微环境是一个广义概念，其内涵远不止于微小环境中免疫细胞的作用，肿瘤细胞与组织之间同样存在微环境层面的相互作用。今日要探讨的这篇文章，由清华大学医学院郑撼球副教授团队携手青岛大学附属医院岳斌教授共同完成，发表于影响因子达 17.3 分的 Nature 子刊《
Nature Cell Biology》（这篇文章，在机制的研究中还是挺有意思的，他们通过假设的假设迭代，不断地推进验证结果，通过严谨的科研推理过程得到了最后的结论，很值得学习，不清楚科研推理和假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑》和《信号通路是什么鬼？》系列），内容聚焦于微环境中乳腺癌细胞与成骨细胞间的相互作用（Crosstalk），饶有趣味。
研究开始，团队着眼于乳腺癌细胞骨转移这一关键课题，探寻其中的关键因素。他们的首要步骤，是利用骨转移能力更强的 4T1.2 细胞构建小鼠骨转移模型，随后开展单细胞测序分析。（如下方的 tSNE 图，其原理是将多维的 PCA 进行降维处理，依据单细胞测序结果中基因表达的差异来实现细胞分簇。若对该图不太理解，可回顾《列文虎克读文献》和《夏老师带你读文献》查阅相关解析。）从单细胞测序结果可见，早期骨转移细胞与晚期骨转移细胞分属不同细胞簇。
在转移早期，增殖相关信号通路以及 EMT相关信号通路显著活跃（EMT就算上皮间质转化的信号通路， 是肿瘤细胞迁移侵袭过程中的关键信号通路，若有遗忘，可查阅《信号通路是什么鬼？》系列进行复习）。而在骨转移后期的溶骨期，肿瘤细胞发生 EMT 的反向转变，即从间质细胞表型转换为上皮细胞表型。
紧接着，团队开展了 cDNA 文库筛选工作（该筛选方式与 CRISPR 筛选相反，可参考《列文虎克读文献》中对 CRISPR 筛库的介绍。CRISPR 筛库是通过随机敲除基因来筛选，而 cDNA 文库筛选则是基于随机的基因过表达进行）。经筛选，他们锁定了一系列与肿瘤细胞骨转移呈正相关的基因。
在这些基因中，团队选中了 LTβ 进行深入研究。为何对 LTβ 情有独钟？原来，尽管 LTβ 作为免疫相关基因已有研究基础，但在骨转移领域尚无相关报道。随后，团队依据柯霍氏法则对 LTβ 展开验证（即通过在肿瘤细胞中敲减 LTβ，去除这一因素后观察肿瘤细胞的骨转移功能变化。若对柯霍氏法则不甚了解，可查阅《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡台》）。结果显示，LTβ 缺失会抑制肿瘤细胞的骨转移进程，这表明 LTβ 可能在促进骨转移方面发挥作用，且对原发性肿瘤生长和肺转移并无影响。
证实 LTβ 对肿瘤细胞骨转移的重要性后，仅靠敲减 LTβ 不足以充分验证其促进骨转移的功能。于是，团队开展了另一项实验：在惰性乳腺癌细胞（即原本无骨转移能力的乳腺癌细胞系）中过表达 LTβ。结果发现，LTβ 能够重新赋予这些惰性乳腺癌细胞骨转移能力。
那么，LTβ 是否通过促进肿瘤细胞自身的迁移能力来推动骨转移呢？团队借助 Transwell 等实验进行分析，结果表明 LTβ 对癌细胞的迁移和侵袭能力并无影响。同时发现，原发性肿瘤中 LTβ 的表达量较低，而当肿瘤细胞转移定植到骨组织后，LTβ 的表达显著升高。进一步研究发现，肿瘤细胞与成骨细胞或间充质干细胞（成骨细胞的祖细胞）共培养时，会促使肿瘤细胞表达 LTβ；使用成骨细胞产生的细胞因子，如 RANKL 等，同样能提升肿瘤细胞 LTβ 的表达水平。这清晰地表明，在骨微环境中，肿瘤细胞会被成骨细胞诱导表达 LTβ。
明确成骨细胞对肿瘤细胞 LTβ 表达的诱导作用后，作为 TNF 家族成员的 LTβ 又会对成骨细胞产生何种影响呢？团队用人重组的 LTα1/β2 蛋白处理成骨细胞，随后进行二代测序分析。
结果显示，LTβ 能够激活成骨细胞的 NFκB 信号传导（NFκB 信号通路与炎症密切相关，下游会激活很多炎症相关的细胞因子的转录，所以在免疫细胞的研究中都经常会遇到，若需回顾相关知识，可查阅《信号通路是什么鬼？》系列）。LTβ 激活 NFκB 后，会诱导 CCL2、CCL5 和 CXCL10 的表达；当抑制 LTβ 时，成骨细胞中 CCL2、CCL5 和 CXCL10 的表达随即被阻断。而成骨细胞产生的 CCL2/5 蛋白，可显著增强肿瘤细胞的增殖能力。至此，肿瘤细胞与成骨细胞之间的相互作用（Crosstalk）逐渐明晰。
团队进一步探究 LTβ 对肿瘤细胞与成骨细胞黏附的影响。通过体内外实验发现，LTβ 能够促进肿瘤细胞黏附并定植到骨组织。前文已提及，LTβ 可促使惰性肿瘤细胞发生强溶骨性骨转移。而 CCL2/5 恰好是参与破骨细胞生成的趋化因子，当团队敲除巨噬细胞（前破骨细胞）的 CCL2/5 受体后，成功阻断了 LTβ 诱导的肿瘤细胞骨转移。这意味着，LTβ 很可能依赖于 CCL2/5 介导的巨噬细胞（前破骨细胞）募集以及破骨细胞生成来促进骨降解。
至此，研究表明 LTβ 极有可能是乳腺癌骨转移的关键靶点。于是，团队采用 LTβR - Ig（LTβ 诱饵受体）对骨转移乳腺癌的小鼠模型进行治疗。结果令人振奋，LTβR - Ig 能够有效抑制骨转移，这充分证实了 LTβ 作为骨转移潜在治疗靶点的可能性。
最终，研究形成了如下作用示意图：在肿瘤细胞与骨细胞相互作用（Crosstalk）过程中，成骨细胞分泌的 RANKL 及其他因子，可能激活肿瘤细胞表达 LTβ。肿瘤细胞产生的 LTβ 则可激活成骨细胞的 NFκB 信号通路，引发 CCL2/5 等趋化因子的表达。同时，肿瘤细胞的 LTβ 还会促进自身与成骨细胞的黏附，助力骨定植。另一方面，成骨细胞受 LTβ 诱导产生的 CCL2/5，可促使巨噬细胞（前破骨细胞）向破骨细胞转化，加速骨降解，进而导致 LTβ 诱导的强溶骨性骨转移。
这篇文章从目标基因筛选，到深入剖析作用机制，研究工作完成得相当出色。通过对 LTβ 机制的研究，将其拓展为乳腺癌骨转移的潜在靶点，极大地提升了研究成果在实际应用中的价值。好了，今日分享到此为止。若大家感兴趣，不妨阅读原文，希望能对大家有所助益。
（本文为夏老师个人观点，仅讨论文章本身，对超出文章以外的内容并不多做评价，如有异意，欢迎在评论区讨论）
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