文章主要介绍了国自然项目中细胞实验的设计要点，包括选择合适的细胞、细胞系的分类及其对应研究问题，以及原代细胞和分化诱导细胞的应用。文章强调了在国自然项目中，设计严谨的重要性，并指出了常见的设计漏洞。
根据实验需求选择细胞系、原代细胞或分化诱导的细胞。选择时需考虑细胞的来源、遗传背景及与临床问题的对应性。
细胞系分为肿瘤和非肿瘤研究的常用细胞系。在肿瘤研究中，细胞系的选择需与肿瘤分型对应，同时要考虑其遗传背景；在非肿瘤研究中，原代细胞和分化诱导的细胞是重要的实验资源。
原代细胞和分化诱导的细胞在国自然项目中是必要的实验部分，它们更贴近病灶组织的病理状态，提供了宝贵的实验数据。
在国自然项目中，设计严谨的实验方案至关重要。评审专家常常关注实验设计的漏洞，如选择合适的细胞、构建疾病模型等。
国自然很快就提交了。在国自然项目中，细胞实验一般都是必选项，在功能和机制实验中通常都要涉及。但越是“常规”实验，设计严谨就越难，下面就尽量详细说明要考虑的因素。
一、如何选择合适的细胞？
细胞的选择是设计要考虑的第一步，有了合适的细胞才能构建疾病模型，进而对我们关注的“基因”或者“药物”进行干预：比如对基因进行沉默、过表达操作，药物处理等等。但是，“没有说明为何选择某某细胞”是国自然项目中评审专家常常指出的设计漏洞。
简单来说，根据细胞的获取方式一般我们分为这三类：A. 细胞系（或者永生化的细胞）；B. 原代细胞；和C. 分化诱导的细胞。
细胞系（或永生化细胞）在肿瘤研究和非肿瘤研究中都常用，主要看细胞系的来源。肿瘤研究中不管是单独研究肿瘤细胞的增殖、转移、耐药等问题，还是与肿瘤微环境中的免疫细胞通讯等都是常用手段。需要注意的问题有几个：
比如肿瘤细胞系与病理分型要对应，肺腺癌vs肺鳞癌vs小细胞肺癌，所用细胞系不同（A549、H1299等为肺腺癌细胞系，NCI-H520为肺鳞癌细胞系，而SHP-77为小细胞肺癌细胞系）；HepG2细胞系为肝母细胞瘤细胞系，而研究原发性肝癌用Huh7、Hep3B以及MHCC97H等更为严谨。
再如细胞系的遗传背景也要考虑：同为肺腺癌细胞系，A549和H460为p53野生型（WT），而H1299为p53缺失、H1975和HCC827为p53 R273H突变（P53的热点突变），如果恰巧研究选的是H1975和HCC827，严格来说结论就只能限定在p53 R273H突变性肺腺癌，而非广义的肺腺癌。当然，要与临床问题对应需要有现成的细胞系可供选择，如果实在没有就要考虑自建细胞系或者在已有细胞系上改造构建。
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2. 细胞系要与临床问题对应
比如研究淋巴结转移、脑转移等问题时，如果没有淋巴结转移、脑转移专门的细胞系，一般就会从现有细胞系建立动物模型从淋巴结组织、脑转移灶筛选构建；当然另外一个策略是从细胞系出发，关注转移灶大小和数量，但创新性略差；
再比如研究肿瘤耐药，虽然分为原发性和继发性耐药，大家关注更多的是继发性耐药，因此一般从耐药细胞株的构建开始，虽然筛选耐药细胞株比较耗时且长期培养会丢失耐药性。
A3.细胞系与研究基因对应
先说一个常见的观点：如果A基因在肿瘤高表达，在肿瘤细胞系就要做敲降/敲除；如果低表达，就要做过表达。这个观点是片面甚至是错误的，原因在于没有搞清楚两个问题：
Q1 当A基因高表达时, 为什么要做A基因的沉默（KD/KO）?
Q1：如果A基因高表达，促进肿瘤发生发展；A基因沉默后，肿瘤发生发展被抑制，说明A基因可以作为药物治疗的靶点，对开发靶向A的药物治疗肿瘤有理论支撑；
Q2 在细胞层面要对A基因进行沉默或者过表达，要考虑真正因素是什么？
Q2：A在不同细胞系中的本底表达有高有低，表达高的细胞系做沉默（KD/KO），表达低的细胞系做过表达。
因此，在对A基因做沉默和过表达之前，应先检测不同细胞系的表达量，然后选择高表达的细胞系做沉默（KD/KO）、选择低表达（或者无）的细胞系做过表达。而且，为了排除脱靶效应（shRNA、sgRNA等都有脱靶效应），还要有沉默（KD/KO）+过表达、以及沉默（KD/KO）+显性失活突变（Dominant Negative）。
当然还有几个注意事项，就不展开说了，比如先前报道过的“细胞系污染和用错”的问题：
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再比如有的细胞系的生长特征为成簇生长，几乎没有迁移运动能力，但是文章和基金中做Transwell侵袭迁移实验的大有人在，如果真碰到懂行的专家，是有可能上升到学术诚信问题的！
除了这个几个问题外，细胞系（或者永生化的细胞）也常用于非肿瘤研究，比如平时我们用的最多的两种“巨噬细胞”RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系）和THP-1（人单核细胞白血病细胞系，THP1诱导为巨噬细胞后使用）。需要注意的是由于细胞系（或者永生化的细胞）在功能特征上有一定的肿瘤样特性，与组织内的巨噬细胞有一定的差别，这就使得原代细胞成为国自然项目中必要且必需有的一部分内容。
与细胞系相比，获取原代细胞的难度更大，但由于更贴近病灶组织的病理状态，因此是好的研究和国自然项目中必备的，而“缺少原代细胞验证”正是最常见的研究设计缺陷之一。因此原代细胞的验证是必须的。反之，如果能提供原代细胞分离和鉴定的数据（比如形态图、免疫荧光染色等“漂亮高端”的图），也是给预实验加分的地方。
当然，如果从组织（特别是小鼠）中获取的原代细胞量太少，少到只能做分析，而不能培养做功能实验的时候，就要考虑下一个选项——分化诱导了。
从iPSC等细胞进行定向诱导分化，以得到足够量的用于功能实验的细胞。实际上，分化诱导细胞的策略与原代细胞在技术路线上还有一个很大区别：
原代细胞可执行“建疾病的动物模型——分离细胞——指标检测”的技术路线，即先动物建模，再分离细胞；
而诱导分化细胞则走“iPSC等诱导细胞——建立疾病的细胞模型——指标检测”的技术路线，即先获取细胞，再建疾病模型。
同样的道理，如果能提供iPSC定向诱导分化好的的数据（比如形态图、免疫荧光染色等“漂亮高端”的图），也是给预实验加分的地方。
另外，iPSC定向诱导分化的细胞虽然少用，但在特定研究中具有不可替代性。
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