JACS丨韩达/郭沛/陈广勇团队揭示亨廷顿舞蹈症相关小CAG重复序列RNA相分离及其结构基础

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生物大分子通过相分离形成的凝聚物参与细胞的多项生理过程，而由突变或者压力导致的异常凝聚物则与癌症、神经退行性疾病的发生发展相关。因此，对生物凝聚物形成机理的探索有助于理解相关细胞功能和疾病发生的分子机制。自2017年Jain和Vale报道CAG RNA重复序列在体外和细胞内形成凝聚物以来，越来越多的研究表明RNA可作为凝聚物形成和功能的主导因素。然而，此前工作多关注基于多价相互作用、长度依赖的RNA相分离，对结构介导的RNA相变行为鲜有研究。

近日，中国科学院杭州医学研究所韩达/郭沛/陈广勇团队在J. Am. Chem. Soc.上发表了题为 Small CAG Repeat RNA Forms a Duplex Structure with Sticky Ends That Promote RNA Condensation 的研究论文，首次报道了亨廷顿舞蹈症（Huntington’s Disease, HD）中仅含有6至7个CAG RNA重复单元的小CAG重复序列RNA（small CAG repeat, sCAG RNA）通过形成特殊结构介导凝聚物的形成，降低了RNA相变对链长的依赖，凸显了RNA结构在相分离过程中的重要性。

sCAG RNA在体外形成凝聚物

研究团队发现，HD中致病性的G(CAG)₇C RNA能够在含有Mg²⁺的缓冲液中经退火后形成微米尺寸的凝聚物（图1a-c）。碱基互补配对和静电作用对该凝聚物的形成至关重要（图1d）。在凝聚物内部，RNA的流动性较低，呈现类似凝胶的状态（图1e）。此外，更短G(CAG)₆C、G(CAG)₅C、 G(CAG)₄C也可以形成类似的凝聚物（图1f-g）。值得关注的是，上述仅含有4至7个CAG重复单元的sCAG RNA形成的凝聚物与含有超过20个CAG重复单元的扩增RNA相似，表明多价相互作用可能不是调控RNA相变的唯一因素。

图1. sCAG RNA在镁离子溶液中形成凝聚物。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

sCAG RNA在Mg²⁺溶液中形成带有粘性末端的双链结构

作者随即探究了sCAG RNA的溶液结构。在Mg²⁺溶液中，G(CAG)_4-7C RNA形成二聚体。利用液体核磁共振波谱实验结合约束型分子动力学模拟（restrained molecular dynamic simulations, rMD），作者表征G(CAG)_4-7C RNA通过 “错位”的形式形成带有两个3′-AGC粘性末端的双链结构。其解析的G(CAG)₄C RNA不含有首尾“固定”序列，是CAG RNA纯重复序列的首个高分辨率三维结构（PDB ID: 9KAD）。

粘性末端上的stickers促进sCAG RNA凝聚物的形成

作者将sCAG RNA双链结构拆解为为由腺嘌呤形成的spacers和由鸟嘌呤-胞嘧啶形成的stickers。其中，7个stickers位于螺旋区参与碱基互补配对，1个sticker在粘性末端，保有与其他stickers相互作用能力（图2a）。核苷酸突变实验表明，粘性末端stickers的存在对sCAG RNA凝聚物的形成起决定性作用（图2b），可能通过介导凝聚物内部交联分子网络的形成捕获相分离状态（图2c）。

图2. sCAG RNA粘性末端上的stickers对凝聚物的形成至关重要。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

作者随即利用粗粒化分子动力学模拟（coarse-grained molecular dynamic simulations, CG-MD）从核苷酸层面解析粘性末端stickers促进凝聚物形成的原理。在凝聚物的形成过程中，G(CAG)₇C RNA双链粘性末端上的stickers通过与另一双链分子的stickers相互作用，触发双链融合形成寡聚体，寡聚体随即继续与单链、双链、寡聚体融合，形成凝聚物。

sCAG RNA在细胞内形成凝聚物

最后，作者表征了sCAG RNA在HEK293T细胞核中形成液滴状凝聚物，表现出与扩增的G(CAG)₄₇C RNA凝聚物类似的流动性（图3 a-d）。在细胞内，sCAG RNA凝聚物的形成仍然受到双链粘性末端stickers的调控（图3e）。此外，sCAG RNA凝聚物与核斑点共定位，表明sCAG RNA可能影响RNA剪切功能（图3f）。