撰文 | 宁

Karim Labib等揭示后生动物DNA复制起始过程依赖DONSON蛋白）等，它们的确切功能还尚有争议。长期以来，如何在每个复制起点上正确组装和激活这两个CMG解旋酶依旧是一个未解之谜【1】。

图1 复制小体的组装【2】

复制小体的组装是DNA复制中的关键步骤，包括以下几个过程。I.解旋酶的组装：在细胞周期的G1期，复制起点被识别，两个Mcm2-7复合体被装载到dsDNA上，形成前复制复合体（Pre-RC）。II. DDK依赖的复合体组装：DDK，即Dbf4依赖的Cdc7激酶驱动早期复制起点招募Cdc45和Sld3。III.解旋酶活化：S期细胞周期依赖激酶S-CDK被激活，使解旋酶活化蛋白GINS被招募到Pre-RC上，形成一对CMG解旋酶。而后两个解旋酶被活化，每个解旋酶结合解链的DNA。IV.完整复制小体的组装：聚合酶、核酸酶和结构支架等其他复制蛋白招募到解旋酶上，形成成熟的复制小体。其中CMG的组装过程和活化机制尚未阐明。

近日，来自斯坦福大学医学院的Gheorghe Chistol研究团队在Cell杂志上发表了文章Single-molecule imaging reveals the mechanism of bidirectional replication initiation in metazoa，发现DNA双向复制的起始是一个动态的过程，涉及TopBP1、Cdc45、DONSON、GINS和RecQL4等多个蛋白的有序招募，加深了人们对复制起始过程中解旋酶组装和活化的理解。

为了能够实时监测复制的起始过程，研究人员以λDNA和GINS耗竭的非洲爪蟾卵子提取物为研究对象模拟复制起始过程，通过人工添加带有荧光标记的GINS，开发了一种名为KEHRMIT（kinetics of the eukaryotic helicase by real-time molecular imaging and tracking，真核解旋酶动力学的实时分子成像和追踪技术）的单分子成像技术，并使用全内反射荧光（Total internal reflection fluorescence ，TIRF）显微镜实时监控复制过程（如图2）。

图2. 复制起始阶段GINS招募的可视化流程

基于这一技术的建立，研究人员尝试解决DNA双向复制的建立和触发机制这一关键科学问题。研究人员通过在复制过程中加入带有荧光标记的GINS、Cdc45、TopBP1、RecQL4和DONSON等蛋白，并通过比较蛋白结合和复制起始触发的延迟时间，确认复制起始因子招募的时空顺叙。发现尽管Cdc45或GINS单体能够与复制起点结合，但是解离速度很快，不能触发单向的DNA复制。而当两个Cdc45分子或GINS同时被招募到预复制复合体（pre-RC）时，能够长时间结合，其中55%的复合物能够触发DNA双向复制。然而单独的Cdc45和GINS不能二聚化，这一过程可能需要其他蛋白作为GINS或Cdc45招募的适配器。

TopBP1、DONSON和RecQL4都能形成二聚体，且与复制起始相关，是潜在的二聚化支架。因此研究人员通过单分子成像技术分别检测了这三种蛋白进入复制起始点的时空顺叙和功能（如图3）。研究表明，TopBP1在DNA合成开始前，先于Cdc45和GINS短暂结合到复制起点并解离，其作用在于稳定Cdc45和Mcm2-7的弱结合，并作为GINS·DONSON·DONSON·GINS复合体招募的支架。DONSON二聚体能够作为GINS招募的支架，装载两个GINS分子同时到达复制起点，完成两个CMG解旋酶的组装。但Cdc45的支架蛋白尚不明确。之后DONSON依旧稳定的结合在复制起点上，此时CMG仍为失活状态。后续研究人员发现RecQL4被招募到CMG、DONSON、DONSON、CMG复合体，在GINS招募后到达复制起始点，并促进DONSON解离和CMG激活，这一过程通过其ATP酶活性实现。

图3. 后生动物复制起始示意图

综上，本文通过单分子成像技术实现DNA双向复制起始的可视化，发现TopBP1、Cdc45、DONSON、GINS和RecQL4等多个蛋白的招募是一个有序的动态过程。这项研究揭示了复制起始过程中解旋酶组装和活化的精细调控机制，加深了人们对后生动物DNA双向复制起始机制的理解，这些发现可能对癌症和其他与DNA复制缺陷相关的疾病有重要意义。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.024

制版人：十一

参考文献

1. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.024

2. Heller RC, Kang S, Lam WM, Chen S, Chan CS, Bell SP. Eukaryotic origin-dependent DNA replication in vitro reveals sequential action of DDK and S-CDK kinases. Cell. 2011 Jul 8;146(1):80-91. doi: 10.1016/j.cell.2011.06.012.

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