Nat Immunol | 陈昕等揭示两种调节性T细胞在人体维持免疫耐受中发挥的作用（微信文章未删减版）

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在免疫学领域，如何在对自身抗原保持耐受的同时对外来抗原发起强有力的免疫反应，一直是一个核心问题。现代对这一问题的研究开启于Goodnow对B细胞耐受性的分析 (PMID: 3261841)，以及Sakaguchi及其同事发现一种表达转录因子FOXP3（Forkhead box protein P3）的CD4+ T细胞亚群 (PMID:8760792)，这一亚群被证明在预防自身免疫中起着关键作用。最近在小鼠中发现了另一个与控制自身反应相关的CD8+ T细胞亚群 (PMID:1375398/26472910)。这些CD8+ T细胞在小鼠中表达编码Ly49基因家族成员的基因，在人类中表达杀伤性免疫球蛋白样受体（Killer Immunoglobulin-Like Receptors, KIRs）的基因(PMID:35258337)，这些T细胞在感染后预防自身免疫中发挥了关键作用，同时在人类自身免疫疾病中也表现出升高。因此，至少有两种主要类型的调节性T细胞在维持免疫耐受中发挥作用，但它们的具体功能尚未被广泛研究。

2025年1月13日，来自美国斯坦福大学的Mark M Davis研究团队，共同第一作者陈昕博士和Mustafa Ghznizada在Nature Immunology杂志发表题为Differential roles of human CD4⁺ and CD8⁺ regulatory T cells in controlling self-reactive immune responses的研究论文。作者利用人类扁桃体类器官系统来探究两种调节性T细胞在人体维持免疫耐受中发挥的作用。这一系统在受到流感疫苗和其他疫苗刺激时，可以重现体细胞高频突变和亲和力成熟、B细胞成熟的过程，并产生特异性抗体。在本研究中，作者通过敲除（KO）与功能相关的FOXP3或GZMB关键基因，分别禁用这些扁桃体中的CD4+和CD8+调节性T细胞（Tregs），并评估其对自反应性B细胞和T细胞的影响。

作者发现在几乎完全缺失FOXP3或GZMB基因的总T细胞中，扁桃体类器官表现出炎症特征，与野生型（WT）相比，被激活的CD4+和CD8+ T细胞中表达CD38和CD27的细胞比例增加。此外，GZMB KO扁桃体类器官中激活的T滤泡辅助细胞（Tfh）的比例显著升高。在两种基因敲除条件下，扁桃体类器官的大多数供体中生发中心B细胞（CD38+CD27+）和浆母细胞（CD38++CD27++）的比例均增加。

尽管在两种基因敲除（KO）扁桃体类器官的B细胞中观察到了炎症表型，但相比于野生型（WT）扁桃体类器官，即使在培养中加入自身抗原，也未发现自身抗体的显著变化。先前的研究表明，病毒感染可能是引发自身免疫疾病的主要因素之一，且在小鼠模型中，病毒感染后会出现自身免疫表型。因此，作者进一步研究了减毒活流感疫苗（LAIV）是否能够在生发中心诱导自身免疫反应。

作者分别用PBS、单独的LAIV或LAIV与自身抗原混合物刺激WT、FOXP3 KO或GZMB KO扁桃体类器官。自身抗原混合物包括蛋白酶3（PR3）、核心组蛋白、双链DNA（dsDNA）和小核核糖核蛋白（snRNP），这些成分是自身免疫疾病患者和病毒感染患者中常见的自身抗体靶标。在WT扁桃体类器官中， LAIV刺激后未观察到自身抗体的显著增加。相比之下，FOXP3KO扁桃体类器官在LAIV和自身抗原刺激后，其自身抗体水平比WT高出多达7倍。此外，作者发现大多数高自身抗体产生的FOXP3 KO扁桃体类器官来源于女性供体，而GZMB KO扁桃体类器官在刺激后分泌的自身抗体水平仅为最低水平。这一结果表明，与CD8+ Tregs相比，CD4+ Tregs在控制自身抗体反应中发挥了更重要的作用。

FOXP3缺失的扁桃体类器官中更高的自身抗体水平使研究人员推测，自反应性B细胞的频率在刺激后也会升高。为验证这一假设，作者设计了一组包含三种“球体多聚体”（spheromers）的试剂。这些试剂是基于改良的最大铁蛋白的高敏感多聚试剂，专门靶向自身抗原蛋白酶3（PR3）、小核核糖核蛋白C和核心组蛋白。

在减毒活流感疫苗（LAIV）存在的条件下，自身抗原混合物显著刺激了FOXP3敲除扁桃体类器官中特异于自身抗原的B细胞扩增，这一结果与观察到的自身抗体水平一致。有趣的是，LAIV加自身抗原刺激后产生最高频率自反应性B细胞的前两例FOXP3敲除扁桃体类器官也来源于女性供体。相比之下，敲除扁桃体T细胞中的GZMB仅对自反应性B细胞的频率产生了轻微影响。这一结果证实，CD4+调节性T细胞通过抑制自反应性B细胞的活化，调节了自身抗体的分泌。

尽管GZMB KO类器官仅引发了轻微的自身抗体反应，但在大多数供体中，作者观察到相比WT，activated T cells的比例有所增加。这表明CD8 Tregs可能对自反应性T细胞反应表现出更强的抑制作用。为了验证这一假设，作者设计了一组包含 “球体多聚体”（spheromers）的试剂,，专门靶向自身抗原蛋白酶3（PR3）、小核核糖核蛋白C和核心组蛋白分析了CD8+调节性T细胞（Tregs）对特异性识别gp100、纤维蛋白原（Fib）或PPI自体肽段的CD8+ T细胞的影响，这些肽段在抗肿瘤反应和自身免疫中具有相关性。这些抗原可被表达HLA-DRB1*04:01+的健康个体的CD4+ T细胞识别。为了评估CD4+和CD8+ Tregs对自反应性T细胞与其他活化T细胞的抑制作用，作者在染色面板中加入了特异性识别流感血凝素（HA）的球体多聚体试剂。

值得注意的是，在由LAIV和自反应性肽段刺激的GZMB敲除扁桃体类器官中，作者观察到特异性识别自身抗原的CD4+ T细胞显著扩增。尽管HA反应性CD4+ T细胞在LAIV刺激后扩增，但在WT、FOXP3 KO和GZMB KO培养条件下，HA特异性CD4+ T细胞的比例没有显著差异。此外，在GZMB KO刺激的扁桃体类器官中，扩增的自反应性CD4+ T细胞大部分来源于女性供体。相比之下，FOXP3敲除并未显著影响特异性识别自身抗原的CD4+ T细胞的频率。

为进一步确认GZMB KO器官中自反应性CD4+ T细胞增加是由KIR+ CD8+ T细胞的功能受损引起的，作者从DRB1*04:01+供体中去除KIR+ CD8+ T细胞，并敲除CD8+ T细胞中的GZMB基因。随后将KIR+和KIR- CD8+ T细胞分别重新引入培养体系，并加入gp100、Fib或PPI中的选定自体肽段和LAIV混合物。在缺乏KIR+ CD8+ T细胞和颗粒酶B的情况下，混合物显著刺激了自体肽特异性CD4+ T细胞的扩增。然而，从同一供体重新引入KIR+ CD8+ T细胞显著降低了自反应性T细胞的比例，而引入等量的KIR- CD8+ T细胞则未显示显著效果。在类似条件下，对HA+ T细胞比例没有显著影响。这些结果表明，CD8+ Tregs是抑制自反应性CD4+ T细胞的强效抑制因子。

总而言之，作者利用CRISPR-Cas9基因编辑技术开发了人类扁桃体类器官的自身免疫模型。通过进行靶向基因敲除，作者研究了两种不同的调节性T细胞亚群的独特作用。在扁桃体类器官中敲除CD4+调节性T细胞（Tregs）的FOXP3基因，显著导致自身反应性B细胞、自身抗体的增加以及抗原特异性抗体亲和力的增强。另一方面，敲除T细胞中的GZMB基因引发CD8+ Tregs的功能失调，导致滤泡辅助性T细胞、自身反应性CD4+和CD8+ T细胞的扩增，同时促进B细胞分化。这些发现与在小鼠模型及患有CD4+和CD8+调节性T细胞缺陷的患者中的观察结果一致。进一步探索扁桃体类器官模型在揭示新机制和转化为治疗自身免疫性疾病方面具有重要潜力。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41590-024-02062-x

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