在 PubMed 的学术海洋中冲浪时，夏老师偶然发现了一篇很有意思的文章。这篇论文由南方医科大学附属广东省人民医院发表于 Cell 旗下、影响因子高达 25.5 分的 Immunity 期刊。它做的是 CD4+ T 细胞在 CMA（分子伴侣介导的自噬，其实是一种由分子伴侣介导并通过自噬将折叠异常的蛋白降解的过程，在《信号通路是什么鬼？》系列的自噬章节中有详细讲解，感兴趣的话可以去看下相关章节
）过程后的变化，内容十分引人入胜。
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研究团队着眼于系统性红斑狼疮（SLE）展开探索。他们发现，SLE 患者的 CD4+ T 细胞中存在大量的滤泡辅助性 T 细胞（Tfh）。CBL 和 CBLB 属于 CBL 家族 E3 泛素连接酶（E3 泛素连接酶能够对底物进行泛素化修饰，通过E2泛素结合酶，将泛素链传递给连接酶，并对目标蛋白进行修饰，这个过程最终会导致蛋白的降解，《信号通路是什么鬼？》系列的泛素化章节里对其有类似 Cullin 和 RING 等的介绍） ，其中 CBL 可调控 T 细胞免疫耐受性。基于此，研究人员试图探究 CBL 和 CBLB 在 SLE 患者中的表达情况，以及它们与 Tfh 细胞之间的关联。研究结果显示，SLE 患者体内 CBL 及 CBLB 表达下调，然而 Tfh 细胞反应却显著增强。
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那么，CD4+ T 细胞中 CBL 的缺失表达，是否会引发 Tfh 细胞分化以及 SLE 的病情进展呢？研究团队运用 CD4-Cre 技术，在小鼠的 CD4+ T 细胞中特异性敲除 CBL（ Cre-LoxP 系统，其实就是通过Cre重组酶，并且利用LoxP位点，将目的基因片段诱导敲除或者敲入的过程，通过特异性启动子诱导Cre酶表达，便能对特定的细胞进行基因操作，在《列文虎克读文献》中有过讲解，可翻找复习）。实验结果表明，敲除 CBL 后，小鼠的 CD4+ T 细胞中 Tfh 细胞反应增强，生发中心反应（GC 反应）被激活，小鼠也呈现出 SLE 的症状。
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在 CBL 缺失诱导的 CD4+ T 细胞中，BCL6 表达显著升高。进一步研究发现，Th1、Th2 及 Th17 细胞并未受到 CBL 缺失的影响，唯有 Tfh 细胞的分化和增殖显著增加。由于 Tfh 细胞的分化和存活受 ICOS 和 OX 信号传导调控，研究人员继而分析 CBL 缺失对这两个信号传导的影响。结果显示，CBL 缺失会影响 ICOS 的蛋白表达（这个验证的过程，其实就是使用了柯霍氏法则的验证方法，通过清除关键的因子，在这里是CBL，来分析对于表型的影响，不清楚柯霍氏法则的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。鉴于 CBL 是一种泛素化酶，研究人员接着检测了 ICOS 在 CBL 表达情况下的泛素化变化，发现 CBL 可通过对 ICOS 进行泛素化修饰，促进其降解，抑制 ICOS 信号传导，进而调控 Tfh 细胞的分化和存活。
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尽管明确了 CBL 和 ICOS 对 Tfh 细胞分化的影响，但下游具体发生了哪些变化仍不清晰。鉴于此前发现 BCL6 的表达在 CBL 缺失后升高，研究人员假设 CBL - ICOS 可能参与了 BCL6 的表达变化。然而，CBL 表达后，并未影响 BCL6 的泛素化，但其表达却有所下降。这很可能是通过自噬导致的降解。于是，研究人员对 BCL6 - mCherry 进行定位（《列文虎克读文献》中讲解自噬时曾讲过这种自噬相关的实验技术，利用了mCherry在酸性条件下不会被淬灭，而GFP则会淬灭这个现象，在自噬过程中，自噬体与溶酶体的结合，使得mCherry和GFP共同进入溶酶体的酸性环境后，查看荧光的变化情况，来分析自噬完成的过程），发现 BCL6 确实能够进入溶酶体，即发生了 CMA（分子伴侣介导的自噬）。参与结合 BCL6 的分子伴侣是 HSC70，BCL6 与 HSC70 结合后，会通过与 LAMP - A 结合进入溶酶体。
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不过，CBL - ICOS 如何调控 BCL6 这一问题仍未解决。研究人员继续深入挖掘，发现神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）与 LAMP - A 结合，并促进 LAMP - A 聚合，使底物易位到溶酶体腔。而 PI3K - AKT 信号通路中的 AKT（PI3K-AKT信号通路是比较常见的信号通路，通过激活AKT这个激酶，呈辐射状对下游通路进行磷酸化的激活或磷酸化抑制，这个信号通路则与很多信号通路，比如NFκB信号通路、mTOR信号通路等等都有密切联系，如果不了解 PI3K - AKT 信号通路，可回顾《信号通路是什么鬼？》系列，该通路较为常见）可对 GFAP 进行磷酸化抑制，磷酸化后的 GFAP 与 LAMP - A 解离，导致 LAMP - A 组装终止。基于此，研究人员假设 ICOS 可以激活 PI3K - AKT 信号通路，通过对 GAFP 磷酸化，抑制 LAMP - A 的组装，进而抑制 BCL6 的 CMA 降解。通过敲除 CBL，研究人员证实了 PI3K - AKT 信号通路中 AKT 的磷酸化，以及 GFAP 磷酸化和 LAMP - A 确实受到 CBL 的影响。
为了验证上述过程是否真的影响了 BCL6 的 CMA 降解，研究人员进行了突变实验。分子伴侣 HSC70 会识别底物 KFERQ 序列，于是研究人员对 BCL6 的 KFERQ 序列进行突变（这种方法相较于直接敲除 HSC70 或 BCL6 进行验证更具优势，通过位点的突变缩小了原有命题中概念的外延，不将表达与否作为验证对象，可避免肯定后件的逻辑谬误，若不了解肯定后件，可查阅《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。结果发现，突变后的 BCL6 不再受 CMA 的影响，BCL6 表达增强，Tfh 细胞反应也随之增强。
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最后，研究人员在人的 Tfh 细胞中进行 CBL 敲减实验。结果显示，CD4+ T 细胞敲除 CBL 后，Tfh 细胞的分化明显增多，同时 BCL6 的 CMA 降解也显著减弱。
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综上所述，研究团队构建出如下作用机制示意图：在 CBL 正常表达时，它会通过泛素化抑制 ICOS 表达，进而抑制 PI3K - AKT 信号通路，下游的 GFAP 促进 LAMP - A 对底物 BCL6 的装载，加速 BCL6 的 CMA 降解。而在 SLE 患者中，CBL 表达显著降低，致使 ICOS 信号增强，激活 PI3K - AKT 信号通路，AKT 对 GFAP 的磷酸化导致下游 LAMP - A 组装失败，BCL6 无法通过 CMA 降解，从而促进 CD4+ T 细胞向 Tfh 细胞分化。![]()
这篇文章的研究内容十分精彩，尤其是解析出 CBL - ICOS 对 BCL6 的 CMA 降解机制，极具价值。若在 BCL6 的 KFERQ 序列突变后，再进行 CBL 过表达实验，那么该通路的证据将会更加完整。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，就看看原文，祝你们心明眼亮。
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