钠过载死亡：细胞死亡的新突破与科研人的新机遇（微信文章未删减版）

正文

细胞死亡是细胞生命过程中的重要环节。目前，常见的程序性细胞死亡形式主要包括凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）、焦亡（pyroptosis）、铁死亡（ferroptosis）、铜死亡（cuproptosis）、**泛凋亡（PANoptosis）和双硫死亡（disulfidptosis）**等。在去年的国家自然科学基金项目中，自噬（autophagy）和铁死亡（ferroptosis）位列资助项目前五名。此外，从国自然热点中标指数来看，程序性细胞死亡相关研究在排名前十的资助项目中占据了近半壁江山，其中铁死亡（ferroptosis）、铜死亡（cuproptosis）、**双硫死亡（disulfidptosis）和焦亡（pyroptosis）**尤为突出，成为当前研究的热点领域。

最近上海交通大学研究团队近期在细胞死亡机制研究领域取得突破性进展，首次发现并命名了一种全新的细胞死亡方式——钠过载死亡（sodium overload-induced cell death）。这一发现不仅拓展了程序性细胞死亡的研究范畴，更为相关领域的基础研究提供了全新的方向。

鉴于目前程序性细胞死亡相关研究已形成较为完善的体系且资助率相对稳定，钠过载死亡这一全新机制的发现，有望成为国家自然科学基金申请的新增长点，为相关领域的研究者提供重要的科研机遇。

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一、研究背景

钠离子内流和过载在组织损伤中常见，钠离子内流的失调会破坏渗透平衡，导致组织水肿，这与组织损伤、中风和肿瘤等疾病有关。然而，钠过载是否像钙、铁或铜那样直接引发细胞死亡，目前尚不清楚。

钠离子浓度由Na+–K+ ATP酶（ATPase）和离子通道严格调控，以维持细胞内低钠和细胞外高钠的水平。钠离子内流对膜电位、动作电位传播和细胞通讯至关重要，并受配体和信号通路等多种因素的调控。钟清团队前期研究发现坏死素1（ necrocide-1，NC1）是一种不同于已知细胞死亡途径的调节性坏死的强效诱导剂。在此，研究人员发现NC1会触发大量钠离子内流、快速膜去极化和细胞水肿。通过CRISPR–Cas9筛选，研究人员确定了瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4（TRPM4）——一种非选择性阳离子通道——是NC1的靶点，它通过钠过载诱导坏死。通过调控钠过载性坏死（NECSO），可能有助于保护细胞或组织免受能量耗竭引起的损伤。调控钠过载性坏死（NECSO）可能为保护细胞或组织免受能量耗竭引起的损伤提供新的治疗策略。这一发现揭示了钠离子在细胞死亡中的直接作用，并为相关疾病的治疗提供了潜在靶点。

二、研究结果

1.通过基因敲除和功能验证来研究TRPM4在NC1诱导的细胞死亡中的作用：

钟清团队前期研究发现坏死素1（NC1）是一种不同于已知细胞死亡途径的调节性坏死的强效诱导剂。它通过未知的机制在特定的癌细胞系中诱导强烈的免疫原性坏死性细胞死亡。使用凋亡（Z-VAD）、坏死性凋亡（Nec-1）、自噬（CQ和3-MA）或铁死亡（Fer-1、Liprox-1和DFO）相关抑制剂来抑制NC1诱导的坏死均未成功。这表明NC1诱导了一种独特的细胞死亡途径。

基因敲除：

首先使用利用CRISPR-Cas9技术（一种基因敲除技术）对MCF7细胞的全基因组进行系统性敲除，通过设计单向导RNA（sgRNA），靶向基因组中的不同基因，从而敲除这些基因的功能。

然后通过深度测序技术，确认sgRNA的成功转染率高达99.9%，筛选出对NC1具有抗性的细胞（即存活下来的细胞）。（高质量sgRNA转染验证并分析这些细胞中哪些基因被敲除，这些被敲除的基因可能是NC1诱导细胞死亡的关键分子，确保筛选实验的可靠性和覆盖度）

使用MAGeCKFlute流程对筛选数据进行分析（计算每个基因的富集分数，以确定哪些基因在NC1抗性细胞中显著富集），TRPM4在分析中表现出最高的富集分数，表明它在NC1诱导的细胞死亡中可能起关键作用。

功能验证：

为了验证TRPM4的作用，使用三种sgRNA生成了TRPM4敲除（KO）的MCF7细胞。TRPM4的删除完全阻断了NC1诱导的细胞死亡（图1b,c和补充图2a）。

重新引入人类TRPM4（hTRPM4）恢复了NC1敏感性，而TRPM4抑制剂9-phenanthrol剂量依赖性地减轻了NC1诱导的细胞死亡（图1d和补充图2b,c）。此外，离子不可渗透的TRPM4突变体D984A未能挽救TRPM4-KO细胞中的坏死表型，证实了TRPM4的离子通道活性对NC1诱导的坏死是必需的（图1d）。这些结果确立了TRPM4在NC1诱导的细胞死亡中的关键作用。

NC1直接结合并激活TRPM4:

通过细胞热转移实验（CETSA）和表面等离子体共振（SPR）分析，证实NC1直接结合TRPM4，亲和力为0.88 μM。NC1的结合稳定了TRPM4，而其无活性异构体（NC1i）则无此效果(图1e、1f)。这些结果表明，NC1特异性结合TRPM4并诱导细胞死亡。

NC1激活TRPM4的离子通道活性：

研究人员使用全细胞膜片钳的结果显示，NC1强烈诱导了TRPM4依赖的电流（半最大有效浓度（EC50）≈306.3 nM），加入TRPM4抑制剂9-phenanthrol后，电流被9-phenanthrol抑制，证实了TRPM4的特异性。在野生型（WT）MCF7细胞中，NC1引发了强电流，而TRPM4敲除则阻断了这一效应（图1g,h）

值得注意的是，在无细胞系统中，NC1在外侧膜片上激活TRPM4，且触发的电流持续增加，即使冲洗后也未减弱，表明NC1对TRPM4的激活是持续且不可逆的。

图1：TRPM4在NC1诱导的细胞死亡中的作用

2.NC1通过TRPM4诱导的坏死由钠离子内流驱动

TRPM4是一种钙激活的非选择性单价阳离子通道蛋白。NC1处理后，钠离子水平增加，钾离子水平下降，而钙、镁和铁离子水平稳定，表明钠离子内流和钾离子外流显著（图2a）。离子敏感探针进一步证实了这些变化：NC1处理的MCF7细胞中，钠离子荧光增加，钾离子荧光减少（图2b,c）。

为确定钠离子内流还是钾离子外流驱动NC1诱导的坏死，将培养基中的NaCl替换为不可渗透的NMDG-Cl。钠离子缺失阻断了NC1诱导的细胞死亡，表明钠离子内流是关键因素；而提高钾离子浓度抑制钾离子外流未影响细胞死亡，表明钾离子外流是伴随事件（图2d,e）。ICP-MS证实钠离子内流和钾离子外流被阻断（图2f），且NMDG-Cl去除钠离子阻断了钠离子内流和细胞死亡，但不影响钾离子外流（图2e,f）。

进一步实验显示，降低EBS中钠离子浓度逐渐减弱NC1的杀伤活性（图2g），用其他单价阳离子替代钠离子不同程度抑制细胞死亡（图2h），突出了钠离子内流的主要作用。TRPM4敲除完全阻断了钠离子内流，证实了TRPM4的关键作用（图2i）。

NC1通过诱导钠离子内流触发TRPM4依赖的坏死性细胞死亡，这种坏死被定义为钠超载诱导的坏死（NECSO）。通过替换钠离子、使用抑制剂和渗透压调节剂，进一步验证了钠离子内流在NECSO中的核心作用。

图2：NC1通过TRPM4诱导的坏死由钠离子内流驱动

3.NC1通过作用于跨膜（TM）区域特异性靶向人源TRPM4通道。

研究了TRPM4表达水平与细胞对NECSO敏感性的相关性，在9种人类癌细胞系中，表达TRPM4的程度对NC1敏感度呈现高度相关性，值得注意的是，尽管部分小鼠细胞的TRPM4表达水平与某些人类细胞系相当，但小鼠和仓鼠的正常及癌细胞对NC1的耐药性比人类细胞高出1,000倍以上（图3a），提示物种特异性差异可能赋予NC1抗性。

为验证NC1是否特异性靶向hTRPM4，我们在TRPM4敲除的MCF7细胞中重新表达人源或小鼠TRPM4 (mTRPM4)。只有hTRPM4能恢复对NC1的敏感性（图3c）。CETSA实验证实NC1结合hTRPM4而不结合mTRPM4（图3d）。此外，NC1激活了hTRPM4通道活性，但对mTRPM4无效（图3e），证明NC1对人源TRPM4的特异性。

实验显示，小鼠等物种的TRPM4同源物对NC1诱导的NECSO无响应,此外，其他TRPM家族成员（包括近缘的TRPM亚型）也不响应NC1（图3h及补充图3a-d）。这些结果表明NC1是hTRPM4的高特异性激动剂，仅在表达hTRPM4的细胞中诱导NECSO。

TRPM4跨膜区决定NC1敏感性

不同物种来源的TRP蛋白对刺激表现出不同的敏感性，这有助于识别参与配体结合或激活的受体结构域。hTRPM4和mTRPM4具有88.4%的序列相似性和相似的四聚体结构，且拥有保守的磷酸化、SUMO化修饰和糖基化等调控修饰。然而它们的NC1敏感性差异显著（图3c）

研究人员通过结构域交换分析确定了NC1敏感性所需的结构域。将hTRPM4和mTRPM4分为三个片段：N端（人类1-767，小鼠1-763）、跨膜区（TM）（人类768-1093，小鼠764-1089）和C端（人类1094-1214，小鼠1090-1213）（图3i）。TRPM4的TM片段包含pre-S1（S0）结构域、S1-S6核心跨膜结构域以及嵌入脂质层的TRP结构域。

替换跨膜区完全改变NC1敏感性（人TM赋予敏感性，鼠TM消除敏感性）（图3i-k），N端或C端交换不影响敏感性，嵌合体功能验证显示人TM可挽救基因敲除表型。证实hTRPM4的TM区在NC1敏感性中起关键作用。

图3： NC1通过作用于跨膜（TM）区域特异性靶向人源TRPM4通道

4.分子对接和点突变实验鉴定NC1激活的关键残基

研究人员使用分子对接：基于hTRPM4结构（PDB 6BQV）预测NC1结合位点，结果显示NC1结合在跨膜区的一个空腔内。该空腔由S3和S4螺旋、一个亚基的S4-S5连接区以及相邻亚基的S5和S6螺旋包围。该区域被称为香草素结合口袋（VBP），是TRP通道中常见的配体门控位点，对接预测NC1与该界面空腔中的关键残基相互作用，这些残基靠近Ca²⁺结合位点（图4a）。

点突变实验：验证关键残基在NC1结合和通道激活中的作用。将W864、H908或F936替换为丙氨酸会破坏NC1结合、TRPM4通道激活和NECSO敏感性（图4d-g）。将M927替换为精氨酸会阻断NC1的结合并消除其效应，而M927A则保留了NC1响应性（图4e,f）。电生理分析显示，这些对NC1无响应的突变体（W864A、H908A和F936A）与非功能性突变体D984A相比，保留了不同程度的离子通透性（图4h）。这些结果证实了预测口袋在NC1诱导的TRPM4激活中的关键作用。

图4：鉴定NC1激活的关键残基

5.能量耗竭诱导的坏死与NECSO具有相似特征，且TRPM4的功能获得性（GOF）突变体表现出对NECSO的敏感性。

TRPM4 的失调与缺血和脊髓损伤中的 ATP 耗竭有关。研究人员检测了能量耗竭条件下的 NECSO。在表达人 TRPM4 的 Cos7 细胞中，2DG 激活了 TRPM4 通道活性。能量耗竭触发了钠离子内流和坏死性细胞死亡，而通过 NMDG 耗竭钠离子可以抵消这两种效应。这些结果表明，能量耗竭也可能诱导 NECSO。

TRPM4 突变与心律失常有关，包括进行性家族性心脏传导阻滞 1 型、布鲁加达综合征和长 QT 综合征，这些疾病可能导致心源性猝死。TRPM4 的功能获得性（GOF）突变与心律失常相关，这些突变可能增强细胞对 NECSO 的敏感性，导致能量耗竭条件下的细胞损伤。TRPM4 在浦肯野纤维中表达丰富，其 GOF 突变可能增加心肌细胞对 NECSO 的敏感性，而 TRPM4 敲除则具有保护作用。此外，TRPM4 在心力衰竭患者的心脏组织中表达上调。

注意：研究团队对此处的研究表明NECSO可能在脊髓损伤、心律失常以及心衰有关，为后续的研究提供了方向。

图5：能量耗竭、TRPM4的功能获得性（GOF）突变体与NECSO的关系

6.两类NECSO的小分子抑制剂

研究通过虚拟筛选和药物库筛选，发现了两类NECSO的小分子抑制剂：克霉唑（CLT）和二氢吡啶类钙通道阻滞剂（DHPs）。CLT通过与TRPM4上的NC1结合口袋竞争，直接抑制NECSO；而DHPs通过靶向L型钙通道（LTCCs）防止TRPM4激活，从而抑制NECSO。这些抑制剂能够有效减少由NC1或能量耗竭诱导的细胞死亡，并保护心肌细胞免受损伤，尤其是对于表达TRPM4功能获得性突变的细胞。