这个项目熬走了多少届研究生

研究背景

肝内胆管癌 （ICC） 是仅次于肝细胞癌 （HCC） 的第二大常见原发性肝恶性肿瘤，全球发病率不断上升，高复发率，患者的长期生存率仍然很差。

研究方法

• 患者和样本：收集了 2010 年至 2016 年 672例ICC患者的肿瘤原发灶和匹配的癌旁样本，其中 204例ICC患者进行了 WES，468例进行了Sanger测序。

• WES：采用罗氏的NimbleGen SeqCap EZ V3外显子捕获试剂盒，在 HiSeq 或 Novaseq 平台 2 × 150 bp 的双端测序。肿瘤样本平均测序深度 445.9x，正常样本平均测序深度 138.7x。测序结果进行了质控，然后BWA比对到hg19，用GATK2对bam进行 local realignment，Sambamba 标记重复。Somatic SNV采用 Mutect 和 Mutect2，Indel 采用Strelka（可能是项目起步较早，用到的软件版本也是早期的），最后用 ANNOVAR 注释。

• 拷贝数变异分析：

• 其他分析：突变特征采用非负矩阵分解 NMF 算法，显著性突变基因采用 MutSigCV 分析，克隆分析采用 pyclone。

• Sanger 测序：随机选择了 1600 SNV + 156 个 Indel 位点，使用Sanger 测序验证突变。另外对 468 个 ICC 样本的 SAV1 基因的所有编码外显子进行 Sanger 测序。

研究结果

• ICC 基因组突变 图谱：在 204名患者中，共鉴定到的体细胞突变位点 21772 SNV 和 1302 Indel。通过Sanger 测序验证到的突变有1756个，95.9%。拷贝数变异鉴定了 17 个显著性扩增片段，其中含有 MYC 、 ERBB2 和 CCND1等癌基因。还发现了 24 个显著性拷贝数缺失片段，其中含有 TP53 （17p13） 和 CDKN2A/B （9q21） 等肿瘤抑制因子（fig1A）。在 204 个 ICC 样本中鉴定了 6 个突变特征，并且和 COSMIC数据库进行比较（fig1B）。基于突变特征，可以将患者分类为9组（Fig1C）。

• 显著性突变基因：使用 MutSigCV 鉴定，发现13 个显著性突变基因（fig2A），部分基因 TP53、KRAS、ELF3 和 SAV1的突变频率要高于其他队列（TCGA MSKCC等）（fig2B）。生存分析发现，携带 TP53、KRAS、ELF3 和 SAV1突变的患者的预后更差（fig2E）。

• 克隆分析：基于pyclone结果，计算shannon index ，将样本分为 “clonal equilibrium” 和“clonal dominance”两组（中位数）（fig3A），生存分析显示，“clonal dominance”的 OS 和 RFS 更差（fig3B）。随后将突变分成克隆和亚克隆（方法里没有找到具体是怎么分的，从图片上看，应该是和CCF相关）， 发现BAP1 、 ARID1A 和 TP53 突变是最早进化的突变，其次是 PBRM1 、 ELF3 和 KRAS 突变。相比之下，ARID2 和 IDH1/2 突变主要局限于发生在较晚时间点的亚克隆事件（fig3C）。

• SAV1 基因突变分析：研究人员对另外 468 个ICC患者的 SAV1基因进行 Sanger 测序，发现了 14个患者存在 SAV1体细胞突变。而 204 例WES患者有6例存在 SAV1 突变。同时该基因也是前面显著性突变基因之一。（但没有看到作者提到为何着重关心这一个基因）。该基因的突变位点分布如fig4A所示。免疫组化分析结果（fig4B）显示，肿瘤样本中的 SAV1 表达下调，SAV1 体细胞突变患者显示肿瘤 SAV1 表达进一步降低。结合临床数据分析：SAV1 体细胞突变与肿瘤大小增加和肿瘤分化不良相关，具有 SAV1 体细胞突变或 SAV1 表达降低的患者表现出更短的 OS 和 RFS（fig4C）。最后进行细胞系实验，验证 SAV1 基因的功能影响。

总结

该研究详细描绘了中国ICC患者的基因组景观，并确定了SAV1作为ICC的潜在驱动基因。SAV1的突变与较低的SAV1蛋白水平、较高的肿瘤复发率和较短的总体患者生存时间相关。研究结果不仅增进了对ICC分子机制的理解，而且为ICC的个体化治疗提供了新的靶点和策略。

写在最后

该研究的时间跨度相对大，比如样本收集是2010~2016，测序用的捕获试剂盒是 罗氏的NimbleGen SeqCap EZ V3，分析方法中用到的是 GATK2，这些都是10年前的产品了。统计分析部分基于R 3.6.2 则是5年前的版本。直到24年才发表。这么多年都不知道熬走多少届研究生了。