Science最新| 聚酯酶序列景观揭示PETase进化图谱

来自：Biosyn 世纪

1. 研究目标与意义

这篇论文旨在通过对 PET 解聚酶的序列景观分析,发掘高活性的天然 PET 解聚酶:

We generated a landscape of 170 lineages of 1894 polyethylene terephthalate depolymerase (PETase) candidates and performed profiling using sampling approaches with features associated with PET-degrading capabilities.

PET 是一种应用广泛但难降解的塑料,开发高效的 PET 解聚酶对于 PET 的回收利用和塑料污染治理有重要意义:

Enzymes capable of breaking down polymers have been identified from natural sources and developed for industrial use in plastic recycling. However, there are many potential starting points for enzyme optimization that remain unexplored.

之前对 PET 解聚酶的研究局限于局部的序列挖掘,缺乏对整个适应度景观(fitness landscape)的认识。而全面的序列映射有望发现更优的 PET 解聚酶:

A comprehensive framework based on sequence mapping of the entire genetic landscape has the potential to uncover superior PET depolymerases.

2. 研究思路与方法创新

论文提出了一个系统的序列景观分析与取样框架(landscaping-and-sampling framework),主要创新点包括:

1. 基于序列同源性,将 PET 解聚酶候选基因映射到二维拓扑空间,生成语义网络(semantic network):

As was done with sequence similarity networks and embedding approaches, sequence homology was used to map sequences into a two-dimensional (2D) topology.

1. 提出了邻域分析(neighborhood analysis)模块,根据每个序列的距离直方图动态调整网络的连通性:

We then devised a neighborhood analysis module, which controls the network stringency from distance histogram data for each sequence.

1. 在生成的序列景观上,使用分层取样(stratified sampling)和群集取样(cluster sampling)的方式,筛选具有代表性的节点进行实验表征。
2. 系统评估了 PET 解聚活性、热稳定性等关键性状在序列空间中的分布。

传统的基于局部聚类或 kNN 的方法容易产生较大的簇,信息分辨率低。而本文的方法能够平衡全局关系和局部差异,获得更精细的聚类结果(Fig. 2)。

3. 探明聚酯酶家族的序列-活性图景,发现90个新PETase

论文通过系统的序列比对和网络聚类分析,构建了一个包含1894个节点、170个分支的聚酯酶-脂肪酶-角质酶超家族序列图谱。

The landscaping approach generated 170 clusters comprising 1894 nodes (2064 sequences) of the polyesterase-lipase-cutinase family, covering the majority of known PETases.

在随后的两轮功能筛选中,作者鉴定出90个此前未报道的PETase:

This study identifies 90 previously unreported sequences with potential PETase activity, of which approximately 90% represent novel groups.

这一发现极大地拓展了已知PETase的序列空间,为后续的筛选和改造提供了丰富的遗传资源。同时,这些酶在进化树中的分布信息也为揭示PETase的起源和进化提供了新的视角。

三个未探索分支中发现高效PETase新家族

Fig. 5: Mipa-P M19 和Kubu-P M12 的结构与性能

在Mipa-P和Kubu-P的基础上,作者进一步开展了定向进化。他们从其他高活性节点的序列中筛选有利突变,引入Mipa-P和Kubu-P,最终获得了性能更优的Mipa-P M19 (19个突变)和Kubu-P M12 (12个突变)(Fig. 5A)。

这两个改造酶在热稳定性、PET降解速率和程度上均有大幅提升(Fig. 5B)。尤其是Kubu-P M12 展现出了卓越的底物适应性和耐受性:

Kubu-P M12 outperformed the engineered benchmarks under high substrate loads in industrial conditions. Kubu-P M12 even endured ethylene glycol as the solvent and reactant in enzyme-catalyzed PET glycolysis, yielding bis(2-hydroxyethyl) terephthalate as the main product at concentrations reaching tens of millimolar.

在20%(w/w)的PET底物负载下,Kubu-P M12 的PET降解速率和程度远高于Mipa-P M19 和LCC-ICCG(Fig. 5C)。当底物负载进一步提高到30%时,这一优势更加明显(Fig. 5D)。此外,Kubu-P M12 还能在以乙二醇为溶剂的糖解反应中保持高活性,在48小时内将产物BHET的浓度提升至21 mM以上(Fig. 6C)。

图6

综上,Kubu-P M12 的发现和创制实现了PETase在活性、稳定性、底物适应性等多个性能指标上的突破,使其真正具备了工业应用的潜力。这也为后续的PETase工程提供了理想的起点。

总结

综上所述,该论文通过系统的序列采样、筛选和定向改造,成功发掘了一系列高性能的新型PETase及其氨基酸组成特征,极大地丰富了人们对PETase的序列-结构-功能关系的认知。同时,Mipa-P M19 和Kubu-P M12 的发现和表征,突破了天然PETase在热稳定性、活性与底物适应性等方面的瓶颈,使其在苛刻的工业条件下仍能高效降解PET,为PET的酶促回收提供了新的技术路线。这些发现为后续的PETase设计和应用研究指明了方向。

4. 学术价值与应用前景

本研究通过系统的序列景观分析,揭示了 PET 解聚酶在进化空间中的活性和稳定性分布规律,为 PETase 的工程改造提供了新的模板和思路。

This study identifies 90 previously unreported sequences with potential PETase activity, of which approximately 90% represent novel groups. These findings provide a broad overview of the distribution of the PETases within the constructed library, enabling relative fitness comparisons.

研究还发现了 3 个此前未探索的 PETase 家系(C3、C25、C158),并从中鉴定出 Mipa-P 和 Kubu-P 两个高效的天然 PETase:

Consequently, this analysis led to the identification of three unexplored protein lineages exhibiting high fitness for PETase activity and to identification of the most potent proteins, Mipa-P and Kubu-P.

在此基础上,研究者通过交叉模板工程(cross-template engineering),将不同来源的有利突变集中到 Mipa-P 和 Kubu-P 上,获得了性能更优的 Mipa-P M19 和 Kubu-P M12 。尤其是 Kubu-P M12 展现出卓越的 PET 降解速率、程度、热稳定性,并能在高底物浓度(substrate load)、乙二醇溶剂等工业条件下保持高活性(Fig. 5,6),有望用于规模化的酶解聚 PET 工艺。

Notably, the Kubu-P M12 variant engineered from a high potential template outperforms benchmarks under industrially relevant conditions.

Kubu-P M12 even endured ethylene glycol as the solvent and reactant in enzyme-catalyzed PET glycolysis, yielding bis(2-hydroxyethyl) terephthalate as the main product at concentrations reaching tens of millimolar.

5. 未来研究方向与机遇

尽管本研究已经取得了里程碑式的成果,但未来在 PETase 的进化机制和工程应用方面仍有许多值得探索的问题:

1. 对 Mipa-P、Kubu-P 的结构机制开展深入研究,理解其高活性的分子基础。
2. 对更多簇的 PETase 进行表征和定向改造,在活性、稳定性、底物适应性等方面实现新的突破。特别是 C1 等含有大量节点的簇可能蕴藏着新的优良 PETase。
3. 在 Kubu-P M12 的基础上,进一步提高其对乙二醇等溶剂的耐受性,在更高温度下实现高效糖解聚,并开发与其匹配的 BHET 分离工艺。
4. 探索其他水解酶家族中 PET 降解酶的序列-功能关系,扩大进化工程的素材库。拓展景观分析方法在其他酶催化反应中的应用。
5. 开发多酶协同的生物降解体系,实现对结晶态 PET 的直接降解,最终实现"生物回收"。

6. Critical Thinking

• 节点产量参数的测定对于酶的筛选很重要。但除了CaPETase、Thc_Cut2 几个节点外,本文大部分 hit 节点的产量比较低(fig. S7),后续改造过程中对表达效果的考察也不详细,实用化还需持续优化工作。
• 本研究在聚酯酶家族中做了广泛的序列采样和活性筛选,但未将其他典型的PET水解酶(如热二嗪菌 PETase)纳入比较,对于定位新发现酶的优劣略显不足。
• 虽然Kubu-P M12 突破了以往PETase在高底物浓度、水含量低等条件下活性和稳定性不足的瓶颈,但离真正的工业应用尺度还有差距,在反应动力学、过程强化等方面仍需攻关。
• 作者提到Kubu-P M12 催化PET糖解产物BHET在低温下结晶析出,有助于分离提纯。但对BHET结晶行为影响因素的分析不够系统,工艺窗口有待进一步圈定。
• 景观构建流程中涉及序列相似性计算、聚类、布局等多个步骤和参数,需进一步讨论其鲁棒性和可重复性。不同的距离度量、网络化方法可能对最终的拓扑结构产生影响。

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Biosyn导师：Kyung-Jin Kim

https://research.knu.ac.kr/en/persons/kyung-jin-kim

Kyung-Jin Kim 教授任职于韩国大邱庆北大学,隶属于生命科学与生物技术学院。他的研究重点为酶工程、结构生物学和塑料回收利用。

• 他是庆北大学生命科学与生物技术学院的教员,同时也隶属于 KNU 创新生物研究团队和 KNU 微生物研究所。
• Kim 教授于1993年在庆北大学获得微生物学学士学位,之后在美国伊利诺伊理工学院生物系获得硕士(1996)和博士(1999)学位。
• 在2012年加入庆北大学担任教授之前,他曾在浦项加速器实验室担任高级科学家(2003-2012)、浦项科技大学担任研究助理教授(2002-2003),并在阿贡国家实验室做博士后研究(2000-2002)。

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