细胞周期是细胞从一次分裂到下一次分裂之间所经历的有序过程，它不仅对生物体的生长、发育和组织修复至关重要，更是维持基因组稳定性的重要机制。细胞周期的四个主要阶段——G1期、S期、G2期和有丝分裂期（M期）——受到精细的调控，以确保细胞在合适的时机进行DNA复制和细胞分裂。在细胞分裂过程中，染色体不稳定性和非整倍性（即细胞中染色体数量的异常）是导致细胞功能紊乱和癌症发生的重要因素。研究表明，染色体不稳定性和非整倍性可以通过多种机制引发，包括中心体的缺失或使用抗有丝分裂药物靶向微管细胞骨架，这些因素都会延迟有丝分裂的进程，并触发细胞在下一个细胞周期的G1期发生p53和p21依赖的细胞周期阻滞。这种阻滞被认为是一种保护机制，旨在防止受损细胞的增殖，从而维护基因组的完整性。然而，在癌细胞中，这种保护性响应常常丢失。这是因为癌细胞中的p53基因往往因突变或其他机制（如病毒癌蛋白的表达）而失活。p53是一种关键的肿瘤抑制蛋白，它通过调控下游基因p21来阻止细胞周期的进程。值得注意的是，即使在没有可检测到的DNA损伤的情况下，延长的有丝分裂也会引发G1期的细胞周期阻滞。这表明，这种阻滞可能并非由DNA损伤引起，而是直接由有丝分裂时间的延长所导致【1,2】。尽管已有研究关注了中心体缺失和药物诱导的有丝分裂延迟对细胞周期的影响，但对于正常细胞功能中有丝分裂延迟如何触发G1期阻滞的分子机制尚不清楚，尤其是其中涉及的关键分子和信号通路。近日，来自英国牛津大学的Francis A. Barr团队在Nature Cell Biology上在线发表了文章MDM2 functions as a timer reporting the length of mitosis，揭示了有丝分裂延迟触发G1期阻滞的分子机制，证实MDM2（一种p53泛素连接酶）是触发G1期阻滞的关键因子，其可通过一种“计时器”机制响应延长的有丝分裂，为理解细胞如何感知和响应有丝分裂异常提供了新的分子机制，不仅增进了我们对细胞周期调控的理解，还可能对癌症治疗具有重要意义。本文研究人员利用表达FUCCI报告系统的hTERT-RPE1细胞系（一种视网膜色素上皮细胞），通过荧光成像和单细胞追踪技术，监测细胞从有丝分裂到G1期的进程。研究发现，大多数p53WT细胞的有丝分裂时间少于60分钟，当有丝分裂时间延长至60分钟以上时，75%的p53WT细胞会在G1期阻滞至少27.9小时，但细胞死亡没有显著增加，而p53敲除（p53KO）细胞则没有表现出这种阻滞现象。此外，研究人员使用低剂量的微管破坏剂nocodazole短暂处理细胞，激活纺锤体组装检查点，模拟有丝分裂延迟。实验结果显示当有丝分裂时间延长超过1小时时，p53WT细胞的后续增殖能力显著下降，而p53KO细胞则不受影响。这些结果表明在有丝分裂中存在一个阈值时间，超过该阈值时间后，细胞在随后的细胞周期G1中经历p53依赖性阻滞，且这种阻滞与DNA损伤无关，而是与有丝分裂时间的延长直接相关。那么，有丝分裂延迟的检测是否与一种生化反应有关，这种反应会消耗p53信号通路中的某个关键调控因子，从而使其作为一种“计时器”，报告有丝分裂的持续时间（图1）。图1 有丝分裂延迟后，有丝分裂计时器通路触发p53依赖性阻滞。p53的水平受E3泛素连接酶MDM2触发的持续合成和蛋白酶体降解的调控。由于MDM2的半衰期较短，维持其稳态浓度需要持续的蛋白质合成。在有丝分裂期间，蛋白质合成受到抑制，因此MDM2的水平会逐渐下降。本文研究人员推测，在正常的有丝分裂中，MDM2的水平虽然会下降，但通常仍高于G1期开始时调控p53所需的临界阈值。然而，当有丝分裂延长时，MDM2的水平可能会降至该阈值以下，从而无法有效调控p53，导致p53稳定化并激活下游的p21，进而引发G1期阻滞。为了验证这一假设，研究人员测量了MDM2在不同细胞系（包括hTERT-RPE1 p53WT细胞和多种癌细胞系）中的半衰期，发现MDM2的半衰期约为30分钟。通过药物诱导有丝分裂延迟发现MDM2在有丝分裂期间的表达水平显著下降，而p53则相对稳定。这些结果表明，MDM2的短半衰期和有丝分裂期间蛋白质合成的抑制使其具有作为有丝分裂“计时器”的特性，能够通过其水平的变化来感知有丝分裂的持续时间。进一步实验结果证实MDM2在有丝分裂期间通过其RING结构域和E2酶的活性进行自催化泛素化，并通过蛋白酶体途径降解，并且其半衰期是独立于典型细胞周期泛素连接酶的固有特性，这一特性使其能够作为有丝分裂“计时器”的关键组分。为了选择性地调节MDM2的稳定性，研究人员使用了MDM2蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）试剂MD-224，其将MDM2结合药物Nutlin-3a的衍生物与Cereblon-Cullin 4A-RBX1 E3泛素连接酶的配体结合在一起，能够通过招募Cereblon E3泛素连接酶复合体来诱导MDM2的降解。实验中当细胞被诱导进入有丝分裂后，在有丝分裂期间MD-224的短暂处理可以降解MDM2，去除MD-224后MDM2又可迅速重新累积到其正常稳态水平。利用该药物进行实验，研究人员发现即使在较短的有丝分裂延迟下，MDM2的降解也会导致p53稳定化和p21积累，从而触发p53依赖的G1期细胞周期阻滞。而在p53缺失的细胞中，这种阻滞并未出现，表明MDM2的降解通过p53发挥作用。这一结果进一步证实了MDM2在有丝分裂期间的降解是导致G1期阻滞的关键因素，支持了MDM2作为有丝分裂“计时器”的功能。随后，研究人员分析了在MD-224存在和不存在的情况下，经历正常长度或延迟有丝分裂的单个细胞所采取的细胞周期途径。实验结果表明经历G1阻滞的细胞比例和G1长度与有丝分裂时间的增加或MDM2水平的降低相关，MDM2水平的降低与G1期阻滞的强度呈剂量依赖关系，MDM2在有丝分裂中存在一个确定的阈值，低于该阈值时，p53稳定化并诱导p21表达，从而触发G1期阻滞。与此同时，研究人员发现，MDM2的水平是决定有丝分裂时间阈值的关键因素，其过表达显著提高了触发G1期阻滞所需的有丝分裂时间阈值，抑制了有丝分裂“计时器”反应。综上所述，本研究揭示了MDM2在有丝分裂延迟触发G1期阻滞中的关键作用，其作为有丝分裂“计时器”的特性是通过其自身的泛素化和蛋白酶体降解机制，以及有丝分裂期间蛋白质合成的抑制来实现的。当MDM2的浓度在有丝分裂期间降至某一阈值以下时，它就无法再有效地降解p53。这导致p53蛋白的稳定化，并进一步诱导p21的表达，最终促使细胞在新的G1期进入持久的细胞周期阻滞（图2）。由此也提示我们MDM2-p53通路的失调可能是癌细胞逃避细胞周期阻滞的一种机制。这些发现不仅为MDM2的功能提供了新的见解，还对我们理解正常细胞如何检测非整倍性以及这种检测机制的失败如何促进癌症中的基因组不稳定性和不受控增殖具有重要意义。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41556-024-01592-8
制版人：十一
1. Yang, Z., Loncarek, J., Khodjakov, A. & Rieder, C. L. Extra centrosomes and/or chromosomes prolong mitosis in human cells. Nat. Cell Biol. 10, 748–751 (2008).
2. Fong, C. S. et al. 53BP1 and USP28 mediate p53-dependent cell cycle arrest in response to centrosome loss and prolonged mitosis. eLife 5, e16270 (2016).
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