药品培养基的质量控制真相（二）

前言：

全文太长，要点太分散容易分散注意力。继续前文的第二部分脱水培养基的质量控制，最后两点：配制灭菌与储存使用。 

配制  

为了保证培养基按照配方配制准确，配制容器和水要求不得带入其他物质。配制容器要求材质方面不得有其他物质释放，并且清洗彻底无残留。配制用水一般是纯化水，但是各种标准中也稍有差别。  

从2015年版中国药典开始，中国药典中收录的培养基配方成分基本与美国药典一致。但是配制过程仍然有不同。中国药典中要求将其他成分加热溶解后再将糖类（例如葡萄糖、乳糖等）、抑菌物质（例如玫瑰红钠）或者指示物质（例如亮绿、中性红、结晶紫等）加入灭菌。美国药典中要求直接按照培养基配方加水溶解后直接灭菌，没有要求分开成分配制，更加符合脱水培养基的实际配制情况。  

分开配制甚至分开灭菌肯定有利于培养基性能的保持，但是操作更复杂，一致性更难保证。我们更应该关注脱水培养基生产商是如何做到混合配制灭菌而培养基性能得到保持的，尤其是那些不耐热的成分是如何灭菌后还能达到有效浓度的。  

换一个角度来说，就是为了脱水培养基的方便配制，质量控制的重心又到了灭菌身上。  

灭菌基础  

D值——微生物耐热参数，指一定温度下将微生物杀灭90%或者下降一个对数单位所需的时间（分钟）。直观的来说，D值大代表杀灭时间长，反映微生物耐受性强。而且微生物在不同的灭菌介质中D值存在差别，如下图。  

思考提示：相同的微生物（例如生物指示剂）在不同培养基溶液中的D值是不是不一样，哪一种培养基中最难杀灭？  

F0值——标准灭菌时间，将121℃及Z=10℃作为参考标准，灭菌物品在获得参照条件下相同灭菌效果的等效灭菌时间。  

从上图可以看出，118℃下灭菌1分钟对芽孢杀灭效果只有标准灭菌条件（121℃及Z=10℃）的50%。121℃灭菌1分钟相当于118℃灭菌2分钟。  

思考提示：灭菌锅的实际灭菌温度很重要，1℃甚至是0.5℃的波动都会给灭菌效果带来较大影响。

灭菌周期——完整灭菌周期如下图所示，包括3个阶段：升温，保温和冷却。由于100℃以下的灭菌率（L）在0.008以下，可以忽略不计。整个灭菌周期的F0值就是图中的阴影面积。

假设某个培养基在121℃的灭菌程序中，培养基中心温度从100℃加热到121℃用了6分钟，121℃保温10分钟，从121℃冷却到100℃又用了6分钟。按照下表进行计算，完整灭菌周期的标准灭菌时间F0值大约为12分钟。

过度灭菌法——一个被灭菌品获得的F0值至少为12分钟的灭菌程序。因为在自然界中的微生物很少有D121℃值是大于1分钟，所以微生物含量从10⁶ 减少至10^-6的无菌保证水平（SAL）只需要12分钟。欧盟在最终灭菌制剂的法规中，将过度杀灭定义为“湿热灭菌121℃15分钟”。过度杀灭法不关心初始污染菌的多少，只要被灭菌物品不会被破坏，都可以通过过度的杀灭程序实现无菌保证水平。  

残存概率法——适用于热稳定系差的产品，F0值常见为8分钟。因为不耐热，所以选择的温度会比121℃低，所以实际灭菌时间就会延长。可以通过灭菌率（L）来换算。假设产品的污染菌的D121℃值不超过1分钟，Z=10，忽略升降温过程的F0值积累，换算如下表。  

对于残存概率法，灭菌前产品中的微生物负载水平和微生物的耐热性决定了灭菌终点。微生物负载水平就是产品污染微生物的数量级水平，微生物的耐热性就反映在D值的不同上。  

脱水培养基的灭菌  

大多数脱水培养基的灭菌程序是121℃15分钟，表面上执行的是过度灭菌法的策略。但是由于培养基灭菌容器体积和灭菌介质的不同会影响穿透性，导致有效灭菌时间会比程序设定时间短。例如培养基生产商要求培养基灭菌体积限制在1L以内，超过这个体积一般灭菌锅已经不能满足要求。饱和蒸汽的导热效率最高，不饱和蒸汽、包装容器壁或者其他介质传导效率都会变差。所以被灭菌产品的包装密封程度也会影响穿透性，也体现在有效灭菌时间的短缺上。  

诸多因素都会对最终灭菌效果造成损失。湿热灭菌程序121℃15分钟不一定就是过度灭菌的情况。如果再遇到装载量过多和不合适包装，即使延长至30分钟也达不到有效灭菌的水平。（链接：微生物废弃物121℃30分钟灭菌够不够？）

思考提示：过度灭菌法内部验证的要点有1）实际温度2）有效时间，而其他因素（包括装载量、包装形式、灭菌体积等）尽量固定或者选择最差情况。如果累加升降温阶段的灭菌效率后，总的F0值也达不到12分钟以上，那就不是过度灭菌法。不是过度灭菌法，就要执行残存概率法的关注重点。

有的培养基的灭菌程序是115℃20分钟，执行的是残存概率法的策略。假设产品的污染菌的D121℃值不超过1分钟，Z=10，加上升降温过程的F0值积累，总的F0值在5.6分钟左右。理论上来说，如果产品的污染菌的D121℃值不超过1分钟，初始污染菌量很低，仍然可以达到10^-6的无菌保证水平（SAL）。  

思考提示：残存概率法除了同样要关注实际温度和有效时间之外，还要关注产品中的初始污染菌量和耐热菌类型。不巧的是，前文“原料控制”部分提到过个别国产蛋白胨样品耐热菌数较高，达390cfu/g。这种类型的培养基出厂报告上应该体现初始污染菌量和耐热菌类型。

而对于一些需要100℃30分钟灭菌的培养基，不推荐使用灭菌锅。因为如果灭菌温度波动至100℃以上会对培养基成分造成比较大的影响。  

另外，100℃以上就有灭菌效果的累积，从灭菌的角度来说肯定希望灭菌时间的延长。比如上面的115℃20分钟的灭菌程序，如果升降温速度慢一点，说不定总的F0值就到6分钟以上了。但是从开始加热以来，培养基成分就会产生美拉德反应，对培养基的营养造成破坏。一个好锅（灭菌锅）的评价标准从来都是：升降温快，保温准。  

储存使用  

制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2～25℃环境下保存，并在经验证的保存期内使用。固体培养基灭菌后的再融化只允许1次，以避免因过度受热造成培养基质量下降或微生物污染。培养基的再融化一般采用水浴或流通蒸汽加热，若采用其他溶解方法，应对其进行评估，确认该溶解方法不影响培养基质量。  

制备好的培养基验证或者评估方式除了可以参考培养基适用性检查的项目外，还可以参考预制培养基生产商的有效期验证方式方法。  

全文很长，要点太多，下次继续：预制培养基的质量控制。

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