今天这篇文章挺有意思，研究巨噬细胞的文章其实也不少，但这篇文章研究的点比较独特。这篇文章就是山东第一医科大学皮肤病医院博士生，发表在21.8分的Cell Mol Immunol上的文章。这篇文章分析了蛋白的糖基化，影响巨噬细胞内生细菌的课题。其实前期的验证还是有一些不够严谨的地方，但在最后通过一个WB的结果，假设迭代后，他们发现关键蛋白的糖基化与表型机制之间存在着联系，这就很有意思了（假设的迭代，就是通过已知的实验结果或者其他文献的佐证，在原有的假设基础上提出新的假设的过程，假设迭代也是推进一篇文章进展的关键，不清楚科研推理、假设或者假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列
）。我们就一起来看看他们都做了点什么吧：
他们研究的疾病是L-Lep（麻风瘤性麻风病），这个疾病是由于M. leprae（麻风分枝杆菌）感染后，进入巨噬细胞调节了免疫反应。他们之前的研究中，通过单细胞测序发现L-Lep中GPNMB的表达水平显著高于T-Lep（结核样麻风病，病灶较少），而L-Lep患者的抗菌先天免疫反应比T-Lep患者较弱。于是他们提出假设，假设GPNMB可能参与了巨噬细胞的抗菌先天免疫变化。在通过CRISPR敲除了GPNMB后，巨噬细胞体外感染M. leprae后发现，巨噬细胞细菌感染时促炎细胞因子的产生明显增强（这一部分验证，其实就是柯霍氏法则的验证，通过移除关键因素GPNMB，来分析对于巨噬细胞抗菌表型以及炎症因子生产表型的影响，不清楚柯霍氏法则的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。这就说明了GPNMB，可能参与了抑制了巨噬细胞遭遇细菌感染时促炎细胞因子的产生：
GPNMB是一种跨膜糖蛋白，而之前的研究表明，在小鼠巨噬细胞和麻风病患者皮肤病变中分离的巨噬细胞中，存在含麻风分枝杆菌的双膜空泡，这说明其间可能存在着异种自噬。于是他们提出了一个新的假设，假设GPNMB能影响巨噬细胞的自噬（假设的迭代就是建立在已有结果，和其他研究的证据之上的，通过假设的迭代可以进一步推进，这里他们考虑到了GPNMB是一种跨膜糖蛋白，而自噬又是一种膜结构相关的生物学过程，同时自噬形成的空泡与感染以及巨噬细胞有一定的关联，于是做出了这样的假设迭代，不清楚假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列）：
通过对于自噬相关的蛋白p62以及LC3的验证，他们发现细菌感染后，GPNMB敲除的巨噬细胞中p62和LC3-II的水平均降低（p62和LC3-II都是常见的自噬相关的蛋白，LC3-II是结合在自噬膜上的蛋白，而p62则会结合泛素化蛋白将降解的物质包裹入自噬体内，自噬体和溶酶体结合后，p62则会被降解，不清楚自噬相关过程的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列的自噬相关几章复习下），也就是说GPNMB在细菌感染时破坏了异噬。使用EBSS促进自噬，导致了p62的降解，而在过表达GPNMB的细胞中p62的降解被消除，也就是说GPNMB阻断了自噬的通量。接着他们发现GPNMB对于自噬通量的影响，主要表现在了自噬体与溶酶体的结合被阻遏了。敲除了GPNMB后LC3单阳性的的囊泡变少，而LC3+LAMP+双阳性的囊泡增多，也就是说GPNMB阻断了自噬体和溶酶体的结合。
那GPNMB是如何影响自噬体和溶酶体的结合的呢？已知的情况是自噬体与溶酶体的融合，是由STX17-SNAP29-VAMP8或者YKT6-SNAP29-STX7这两种SNARE复合物的组装介导的，于是他们用coIP来分别分析了GPNMB与复合体上这些蛋白的互作，结果发现GPNMB可以与STX17结合。接着他们分析了者具体结合的结构域，他们发现STX17的TM结构域的去除，破坏了STX17和GPNMB之间的相互作用。而通过分析STX17-SNAP29-VAMP8复合体上STX17与SNAP29的结合关系，他们发现GPNMB会破坏STX17与SNAP29的相互作用（这一部分验证其实不太严谨，既然之前已经确认了GPNMB与STX17之间的结合，就应该分析两者的结合对于STX17-SNAP29-VAMP8复合体形成的影响，而不是去验证两者的表达对于STX17-SNAP29-VAMP8复合体形成的影响，这就会由于验证的命题中概念的外延不同，导致肯定后件的逻辑谬误，不清楚概念外延或者肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》系列）：
但在最后，出现了一个有意思的转折，由于之前验证coIP的时候，他们发现GPNMB与STX17之间的结合不但会影响STX17-SNAP29的结合，同时在Input中SNAP29的表达也受到了影响。结果他们发现GPNMB的表达，可以促进SNAP29的降解。由于GPNMB是一个高度糖基化的膜蛋白，于是他们假设是否GPNMB的糖基化会对SNAP29降解产生影响。他们通过筛选了GPNMB的12个糖基化位点的突变，来分析GPNMB的糖基化对于SNAP29降解可能造成的影响。结果发现GPNMB的N296Q的突变和N12Q的突变，可以促进SNAP29降解（这里通过对GPNMB糖基化位点的突变，来分析GPNMB去糖基化对于SNAP29蛋白讲降解的影响，也就是说概念的外延在这里得到了合理的缩小，当缩小外延之后，原有的可能存在逻辑谬误的点也都消失了，这样就做到了严谨性，接着他们还继续进行了突变对于自噬的影响，也就是扩大的表型的范围，这一部分的验证是值得认可的，不清楚概念外延或者肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。接着他们分析了GPNMB的N296Q的突变和N12Q的突变，对于自噬通量的影响，结果发现GPNMB的N296的去糖基化，可能会抑制异种自噬并促进感染过程中细菌的存活：
最后就形成了这样的示意图，M. leprae被内吞进入巨噬细胞后，形成了异体自噬的自噬体，通过自噬体和溶酶体膜上的STX17-SNAP29-VAMP8复合体形成，促进了自噬体和溶酶体的结合，促进了对细菌的降解。而GPNMB高表达后一方面糖基化降低，促进了SNAP29的蛋白降解，一方面GPNMB结合STX17，抑制了STX17-SNAP29-VAMP8复合体形成，导致溶酶体无法和自噬体结合，形成了空泡，并降低了巨噬细胞的促炎细胞因子的产生。GPNMB结合STX17，与GPNMB去糖基化后促进SNAP29降解，是两个独立事件：
这篇文章在最后的验证中通过突变，说明了具体的GPNMB去糖基化后促进SNAP29降解的机制，但是对于GPNMB结合STX17却还是有一定的逻辑漏洞的，如果这部分也通过STX17结合位点的突变来进行对后期自噬通量影响的验证，这篇文章会更好一些。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
（本文为夏老师个人观点，仅讨论文章本身，对超出文章以外的内容并不多做评价，如有异意，欢迎在评论区讨论）
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