抓紧上车，焦亡巨噬细胞（微信文章未删减版）

正文

小伙伴们好啊！今天给大家分享一篇今年1月发表在Adv Sci（IF=15.1）杂志上的文章，由中山大学附属第六医院妇产生殖新生儿科首席专家、生殖医学中心主任梁晓燕教授团队发表。本研究通过阐明焦亡巨噬细胞参与的免疫机制，拓展了目前对卵巢衰老过程的理解，为制定延缓衰老和促进生殖健康的新策略具有重要意义。接下来，我们一起学习一下吧！

一、研究背景

衰老是一个自然过程，伴随着疾病和代谢平衡失衡。然而，不同器官的衰老过程并不同步，每个器官都表现出不同的衰老模式。卵巢作为女性内分泌器官，似乎比其他器官更容易衰老。卵巢衰老是一个复杂的过程，炎症衰老是器官衰老的一个重要特征。卵巢衰老的一个既定标志是炎症表型的出现，其中包括促炎细胞因子表达水平升高、胶原蛋白沉积和免疫系统功能失调。巨噬细胞是炎症免疫反应的核心成分，是卵巢中最丰富的免疫细胞，具有维持组织稳态的多种功能。

二、主要研究结果

1.中年女性卵巢功能衰退

作者将生殖中心的347名因男性因素不孕的女性分为两组：<33岁（青年组）和>37岁（中年组）。发现中年组卵母细胞减少、抗缪勒管激素水平下降，证实了中年组卵巢功能下降，还发现中年组卵巢纤维化显著增加（图1A、B），表明卵巢微环境和功能与年龄相关的差异在育龄期已经存在。分子水平上也发现机体衰老标志物CDKN1A和卵巢中相应蛋白P21在中年组增加（图1C、D），表明更年期前，当实际年龄未完全下降时，卵巢就出现了衰老迹象，所以作者对绝经前卵巢衰老机制进行研究。

图1 育龄成人卵巢的单细胞转录组图谱

2.scRNA-seq 揭示了多样化的卵巢微环境

4个青年组和3个中年组样本进行scRNA-seq，根据差异表达基因和先前研究细胞marker，一共识别了9个细胞簇（图1E-H）。细胞在两组中的丰度存在差异，中年组基质细胞（SCs）比例普遍增加，巨噬细胞（Ms）和T细胞（TCs）随着年龄的增长而显著减少（图1I）。

3.衰老相关SCs在中年卵巢中积累

SCs是卵巢基质的主要成分。比较两组SCs中纤维化相关基因（FN1、ACTA2和CCN2）的表达，发现与卵巢纤维化程度增加相一致，中年组SCs比例和纤维化相关基因表达升高（图2A）。不同SCs亚群中，Sc1具有PLA2G2A高表达，与粘附和结构有关，Sc4以胶原相关基因COL1A1、COL3A1和COL5A1为特征，参与ECM形成（图2B）。富集分析结果显示老年组中SCs，尤其是sc1参与卵巢纤维化的发展（图2C、D）。拟时序分析显示青年组的sc0主要位于Pre-branch和Cell state1，而免疫调节相关基因在Cell state1中高表达，而在中年组sc0占据的Cell state2低表达，与微环境信号传导相关的CD44在中年组中表达也显著降低（图2F-H）。

图2 基质细胞衰老随年龄增长而增加

4.卵巢常驻巨噬细胞表现出广泛的异质性，而中年卵巢以焦亡巨噬细胞为主

巨噬细胞是卵巢中最丰富的免疫细胞，有助于卵巢正常的生理和病理变化。卵巢巨噬细胞由组织驻留巨噬细胞（TRMs）和单核细胞源性巨噬细胞（MDMs）组成。这两种巨噬细胞在维持组织稳态方面发挥着不同的作用，TRMs清除衰老细胞和细胞外产物，而MDMs则在炎症发生时由招募的单核细胞分化而来。巨噬细胞进一步分为4个亚群，发现C1QC+、HLA-DQA1+、SPP1+巨噬细胞是TRMs，而VCAN+巨噬细胞是MDMs（图3A-E）。为GO富集分析表明MDMs参与与中性粒细胞浸润和炎症反应相关的生物过程，而TRMs则富集于凋亡细胞消除（图3F）。拟时序分析、RNA速率分析和BEAM分析的结果表明IL1B、CASP1和NLRP3在焦亡过程中富集，而且在Cell state2中逐渐上调（图3G-J）。AuCell算法对单个细胞的焦亡通路活性进行评分，发现VCAN+巨噬细胞簇具有较高的细胞焦亡途径活性，且具有发生焦亡的倾向（图3K）。虽然随着巨噬细胞亚型的进一步转变，焦亡途径活性下降（图3L），但焦亡激活是巨噬细胞亚型转变过程中的因果因素还是伴随结果尚不清楚。

图3 卵巢巨噬细胞表征和细胞轨迹分析

CD14染色表明，中年组巨噬细胞数减少，其中TRMs比例显著降低，但MDMs比例基本不变（图4A、B）。因此，卵巢衰老与高比例的MDMs和低比例的TRMs相关，通过两组之间TRMs和MDMs标记基因的差异表达得到证实。拟时序分析评估衰老对巨噬细胞亚型转变的影响，发现C1QC+和SPP1+ TRMs的比例显著下降，而VCAN+ MDMs的比例增加（图4C、D），表明中年组中VCAN+向SPP1+/C1QC+巨噬细胞的转变受到抑制。中年组焦亡相关基因IL1B、CASP1和NLRP3表达显著升高，而且每个亚群的焦亡活性在两组之间具有可比性（图3K，4E、F）。综上所述，中年卵巢中具有了以高焦亡活性为特征的巨噬细胞。

图4 年龄改变对巨噬细胞及其对卵巢微环境的影响

5.效应T细胞的数量随着年龄的增长而增加

CD3免疫荧光染色表明中年卵巢中T细胞总数减少，但效应T细胞显著增加。

6.卵巢相互作用组随着年龄的增长而发生巨大变化

不同巨噬细胞亚群中配体-受体对分析发现EREG-EGFR，NRG1-LSR和SELL-CD34等在VCAN+巨噬细胞与其他体细胞中广泛存在，而C1QC+、HLA-DQA1+和SPP1+巨噬细胞主要通过SPP1配体与其他体细胞通讯（图4G）。其中EREG、SELL、PLAUR主要在VCAN+巨噬细胞中表达，在中年组表达较高；年轻组则SPP1、NRG1、CD74表达较高（图4H），相应的受体CD44和EGFR在TCs和SCs上普遍表达，衰老相关β-半乳糖苷酶染色评估了SPP1和EREG在SCs中的生物学功能，发现SPP1显著抵抗衰老，并且在EREG治疗后观察到相反的效果（图4I）。这些结果表明，非焦亡巨噬细胞通过分泌SPP1在年轻卵巢中发挥免疫调节作用，与基质细胞相互作用，使它们保持在年轻状态（Cell State1）。而在中年卵巢中，巨噬细胞亚群的比例发生了变化，SPP1表达下调削弱了SCs和T细胞的通讯，促进效应T细胞转变。具有高焦亡活性的VCAN+巨噬细胞成为促炎症微环境中新的通讯枢纽，最终通过EREG-EGFR促进SCs的衰老。

7.焦亡巨噬细胞促进SCs衰老

收集处理过的SCs用于SA-β-gal染色或PCR扩增。与未刺激的THP1上清液（THP1-pma）相比，焦亡的THP1上清液显著增加了β-gal阳性SCs的数量。在用IFN-γ/TNF-α或Nig/LPS诱导的焦亡THP1上清液处理的SCs之间，未观察到β-gal阳性细胞比例的显著差异（图5A），表明IFN-γ/TNF-α或Nig/LPS处理通过促进巨噬细胞焦亡的发展，而不是对 SC 产生直接影响，加速SCs衰老。同时，纤维化相关途径中的关键基因（SMAD2、SMAD3和MMP2）的表达上调（图5B），反映了衰老SCs中ECM蛋白合成的增加。即焦亡巨噬细胞激活SCs中的TGF-β信号通路，促进ECM组成成分的产生，同时加速SCs衰老。IHC染色和ELISA进一步证实了作者的发现（图5C-F）。

图5 焦亡巨噬细胞促进基质细胞衰老

8.抑制焦亡可延缓卵巢衰老并促进女性健康

GSDMD+/-小鼠模型表明GSDMD缺失可以保护与年龄相关的卵巢储备功能下降，细胞焦亡与卵巢衰老相关，而且巨噬细胞焦亡激活可以导致卵巢衰老加速，但GSDMD抑制可能是一种有前途的治疗策略（图6）。

图6 抑制焦亡可阻止卵巢衰老，促进女性健康

三、小结

本研究提供了卵巢细胞图谱，剖析了生殖女性中细胞群和细胞类型特异性基因的年龄相关变化，丰富了‘炎症衰老’理论知识，表明细胞焦亡可能是延缓卵巢衰老过程的潜在治疗靶点。小编认为本研究在研究设计和方法学上也有很多可取之处，研究方法经典，设计上则层层递进，重要研究结论都用生物信息学方法或湿实验加以验证，故事性极强。

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